郁斯貽

【摘 要】環(huán)境DNA（eDNA）技術(shù)是一種運(yùn)用分子生物學(xué)的方法，通過(guò)從環(huán)境樣品中提取DNA并進(jìn)行測(cè)序和分析來(lái)反映物種信息的技術(shù)。eDNA技術(shù)具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，因而被越來(lái)越多地運(yùn)用到了水生生物監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)中。本文從eDNA技術(shù)的發(fā)展歷程、研究方法和應(yīng)用領(lǐng)域這三個(gè)方面對(duì)eDNA技術(shù)進(jìn)行了綜述，總結(jié)了eDNA技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)其未來(lái)的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

【關(guān)鍵詞】環(huán)境DNA;分子生物學(xué);水生生物監(jiān)測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： S932.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 2095-2457（2019）22-0078-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.22.034

0 引言

水生態(tài)系統(tǒng)是人類(lèi)生存重要的自然資源之一。隨著人類(lèi)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和工業(yè)化的發(fā)展，水生態(tài)系統(tǒng)遭到了越來(lái)越嚴(yán)重破壞。因而對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)是非常重要的。水生生物是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。當(dāng)污染物進(jìn)入水體后，會(huì)產(chǎn)生一定的生態(tài)效應(yīng)，對(duì)水生態(tài)環(huán)境造成破壞，影響水體中動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而對(duì)水生生物造成危害[1]。因此對(duì)水生生物開(kāi)展監(jiān)測(cè)能直觀地反映水生態(tài)系統(tǒng)受污染的程度。

傳統(tǒng)的水生生物監(jiān)測(cè)方法是對(duì)浮游生物、底棲生物、魚(yú)類(lèi)等生物開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及采樣，采用形態(tài)學(xué)方法對(duì)所采集到的物種進(jìn)行定性和定量分析。傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測(cè)方法具有一定的局限性，一些密度比較低的生物群體在現(xiàn)場(chǎng)采樣時(shí)比較難以獲得，分析結(jié)果也會(huì)因此而受到影響。且傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測(cè)中的形態(tài)學(xué)鑒定方法對(duì)從事物種鑒定的人員技術(shù)要求較高，有時(shí)對(duì)于樣本的完整性程度要求也比較高。因此，有必要尋找一種更為高效便捷的方法對(duì)水生生物物種進(jìn)行鑒定和分析。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)逐漸被應(yīng)用到物種鑒定中。近些年在水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域里，環(huán)境DNA（environmental DNA， eDNA）分子技術(shù)正被越來(lái)越多的研究者們所應(yīng)用。eDNA是指從環(huán)境中（如土壤、水、空氣等）提取的所有DNA集合，包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來(lái)的活細(xì)胞DNA和因生物死亡后細(xì)胞破碎而游離出的胞外DNA[2-3]。以下從eDNA的發(fā)展歷程、eDNA的技術(shù)方法、eDNA檢測(cè)技術(shù)在水生生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用、總結(jié)與展望這幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，為水生生物監(jiān)測(cè)提供參考。

1 eDNA技術(shù)的發(fā)展歷程

eDNA技術(shù)最早出現(xiàn)于環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域，并在2000年之后逐漸得到認(rèn)可和應(yīng)用。Willerslev[4]等利用eDNA技術(shù)提取了不同國(guó)家和地區(qū)古老沉積物中的DNA，對(duì)生物多樣性、動(dòng)植物的組成及變化等進(jìn)行了研究。Ficetola[5]等于2008年報(bào)導(dǎo)了利用eDNA技術(shù)檢測(cè)淡水中一種蛙（Rana catesbeiana）的存在，這也是首次利用該技術(shù)對(duì)水生生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。隨著eDNA技術(shù)的發(fā)展，其研究范圍也逐漸擴(kuò)大，從最初對(duì)于某一種生物的定性研究發(fā)展到定量研究，研究對(duì)象也從單一物種逐漸擴(kuò)大到了兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、哺乳類(lèi)、爬行類(lèi)等各類(lèi)物種。eDNA技術(shù)的發(fā)展為水生生物的監(jiān)測(cè)提供了新的方法。

2 eDNA研究方法

目前eDNA的主要研究方法有三種：PCR、熒光定量PCR和高通量測(cè)序。與傳統(tǒng)的人工形態(tài)學(xué)方法相比，這三種方法具有省時(shí)省力的優(yōu)勢(shì)。PCR方法主要用于物種的定性檢測(cè)，可檢測(cè)水體中是否存在某一特定的物種。Goldberg等[6]使用PCR技術(shù)檢測(cè)溪流中的洛基山尾蛙（Ascaphus montanus）和愛(ài)達(dá)荷州巨型火蜥蜴（Dicamptodon aterrimus）。熒光定量PCR法可以在定性檢測(cè)物種是否存在的基礎(chǔ)上，對(duì)物種的生物量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱(chēng)二代測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing， NGS），能夠一次對(duì)幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定。NGS技術(shù)與eDNA技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生eDNA宏條形碼（eDNA metabarcoding）技術(shù)。eDNA宏條形碼技術(shù)通過(guò)從環(huán)境樣品中提取DNA，借助第二代高通量測(cè)序獲取其物種組成，進(jìn)而探究群落水平上的生物多樣性。孫晶瑩等[7]以太湖流域常見(jiàn)的5種枝角類(lèi)浮游動(dòng)物為研究對(duì)象，建立了一種基于eDNA宏條形碼技術(shù)的物種定量方法。趙夢(mèng)迪[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了黃海南部和東海北部10個(gè)點(diǎn)位的魚(yú)類(lèi)多樣性和豐度，發(fā)現(xiàn)所鑒定到的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)多為東黃海的常見(jiàn)品種，部分魚(yú)類(lèi)雖不是常見(jiàn)品種，但曾出現(xiàn)在東黃海的記錄中，與此同時(shí)，通過(guò)該技術(shù)獲得的各點(diǎn)位優(yōu)勢(shì)種與當(dāng)次捕撈的優(yōu)勢(shì)種基本相同，證明eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分析法具有較好的一致性。

3 eDNA在水生生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

目標(biāo)物種的檢測(cè)物種入侵、瀕危物種和稀有物種的保護(hù)是重要且亟待解決的生態(tài)問(wèn)題之一。eDNA技術(shù)可通過(guò)檢測(cè)水樣中是否含有特定的DNA序列來(lái)判斷某一物種是否存在。這使得原本復(fù)雜且耗時(shí)的工作變得高效省力。

3.1 對(duì)外來(lái)物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)

外來(lái)物種入侵是21世紀(jì)5大全球性環(huán)境變化問(wèn)題之一，也是全世界最為關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題之一。外來(lái)物種一旦入侵成功，可能會(huì)與本土的物種形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系并成為優(yōu)勢(shì)種，對(duì)全球生物多樣性帶來(lái)影響。入侵成功的外來(lái)物種根除可能性很小且控制成本高，如果能對(duì)入侵物種提前進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在早期就采取措施，那么就有可能提升根除成功率并降低控制成本。近些年來(lái)，eDNA技術(shù)已被逐漸用于外來(lái)物種的監(jiān)測(cè)中，目前在全球范圍內(nèi)利用eDNA監(jiān)測(cè)過(guò)的外來(lái)物種包括：美國(guó)牛蛙、大西洋鮭、亞洲鯉魚(yú)、克氏螯蝦、小龍蝦、莫比魚(yú)等物種。

3.2 對(duì)瀕危和稀有物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)

由于瀕危物種或稀有物種密度低，所以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法很難對(duì)這些物種進(jìn)行監(jiān)測(cè)。且采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法時(shí)需要使用拖網(wǎng)、電捕魚(yú)等采樣工具，易對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成影響。eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比具有更好的靈敏度，且在實(shí)際操作時(shí)直接采集水樣即可，因而能很好地避免這些問(wèn)題，該技術(shù)特別適用于瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測(cè)。目前eDNA技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)歐白鮭、美國(guó)隱鰓鯢、王鮭、澳洲麥?zhǔn)削|等物種的監(jiān)測(cè)。

生物多樣性監(jiān)測(cè) 生物多樣性是衡量某一地區(qū)生物資源豐富程度的客觀指標(biāo)，對(duì)人類(lèi)社會(huì)的生存和發(fā)展具有非常重要的意義。生物多樣性不僅在保持土壤肥力、保證水質(zhì)、調(diào)節(jié)氣候、調(diào)控大氣層成分地標(biāo)溫度等方面發(fā)揮了重要作用，而且生物多樣性的維持有助于珍稀物種和瀕危物種的保存。因此，許多國(guó)家和地區(qū)都開(kāi)展了對(duì)生物多樣性的監(jiān)測(cè)和保護(hù)。傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)技術(shù)存在難以正確識(shí)別一些隱秘物種或幼年生命階段物種的問(wèn)題，因而需要尋找一種能夠快速準(zhǔn)確地進(jìn)行生物多樣性監(jiān)測(cè)的技術(shù)。近年來(lái)，eDNA宏條形碼技術(shù)被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用到了生物多樣性研究中。eDNA宏條形碼技術(shù)是通過(guò)提取環(huán)境樣品中的DNA，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后得到的可操縱分類(lèi)單元（operational taxonomic units， OTUs）進(jìn)行物種鑒定來(lái)獲知物種組成的[9]，從而可探究群落水平上的生物多樣性。eDNA宏條形碼技術(shù)很好地避開(kāi)了傳統(tǒng)生物多樣性監(jiān)測(cè)技術(shù)中的問(wèn)題，快速、高效的特點(diǎn)使其成為了生物多樣性監(jiān)測(cè)較為理想的技術(shù)手段。Thomsen等[10]從丹麥的海洋生態(tài)系統(tǒng)中采集海水，利用eDNA宏條形碼技術(shù)對(duì)海洋中魚(yú)類(lèi)的生物多樣性開(kāi)展了研究。研究共發(fā)現(xiàn)了15種魚(yú)類(lèi)，其中包括了用傳統(tǒng)方法難以監(jiān)測(cè)到的稀有物種。與9種用傳統(tǒng)方法監(jiān)測(cè)到的海洋魚(yú)類(lèi)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)eDNA檢測(cè)到的魚(yú)類(lèi)多樣性與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，這表明eDNA宏條形碼技術(shù)具有水生生物多樣性評(píng)價(jià)的潛力。

生物量的估算 生物量是重要的生物學(xué)參數(shù)之一，但要對(duì)其進(jìn)行精確的估算通常比較困難。采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行生物量估算時(shí)會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成較大的損害。孫晶瑩等[7]利用eDNA宏條形碼技術(shù)對(duì)枝角類(lèi)浮游動(dòng)物開(kāi)展了生物量的監(jiān)測(cè)研究，建立了一種基于eDNA宏條形碼技術(shù)的物種定量測(cè)定方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eDNA宏條形碼技術(shù)可對(duì)浮游動(dòng)物實(shí)現(xiàn)半定量監(jiān)測(cè)，且eDNA宏條形碼技術(shù)與qPCR結(jié)果具有較強(qiáng)的一致性，能較好地反映物種的豐度變化。一些學(xué)者運(yùn)用eDNA技術(shù)對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)中的兩棲動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)等物種進(jìn)行生物量估算，發(fā)現(xiàn)水溫、pH、光照等因素會(huì)對(duì)eDNA的釋放產(chǎn)生一定的影響，間接地影響了生物量的估算。因此，eDNA技術(shù)在生物量估算方面還需要更為深入的研究。

4 總結(jié)與展望

作為一種新型的水生生物監(jiān)測(cè)技術(shù)，eDNA技術(shù)目前已在目標(biāo)種的監(jiān)測(cè)、生物多樣性調(diào)查、生物量估算等方面得到了較為廣泛的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)相比，eDNA技術(shù)具有如下的優(yōu)勢(shì)：（1）靈敏度高：eDNA技術(shù)可用于密度很低的珍稀物種和瀕危物種的定性監(jiān)測(cè)，而傳統(tǒng)方法很難準(zhǔn)確地對(duì)低密度種群進(jìn)行監(jiān)測(cè);（2）高效省時(shí)：與傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法相比，eDNA技術(shù)通常所需的人力、物力和時(shí)間更少;（3）降低了對(duì)人員的要求：傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)技術(shù)需要依靠形態(tài)學(xué)對(duì)物種進(jìn)行定性、定量分析，這就要求研究人員具有很高的分類(lèi)鑒定能力，而eDNA技術(shù)是只需使用分子生物學(xué)方法就可以進(jìn)行物種鑒定，操作更為便捷;（4）采樣受限?。簜鹘y(tǒng)的生物采樣方法受天氣、環(huán)境的影響較大，而使用eDNA技術(shù)時(shí)只需采集一定量的水樣，受外界影響較小;（5）對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)干擾?。簜鹘y(tǒng)的生物采樣方法需要使用捕撈工具，在捕撈生物時(shí)易對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成損害，而eDNA技術(shù)只采集水樣，因而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)干擾較小。

雖然eDNA技術(shù)在許多方面相比傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但依然在某些方面存在一定的問(wèn)題與不足：（1）eDNA技術(shù)的結(jié)果判別需要依靠數(shù)據(jù)庫(kù)，如果數(shù)據(jù)庫(kù)中的生物信息不完備，那么最終檢測(cè)結(jié)果將受到影響;（2）當(dāng)樣品在采集或運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生交叉污染，或是實(shí)驗(yàn)室分析過(guò)程中出現(xiàn)試劑污染問(wèn)題時(shí)，eDNA的分析過(guò)程往往會(huì)受到影響，其分析結(jié)果也會(huì)有所偏差，因而在操作時(shí)所使用的工具、材料、設(shè)備等須提前進(jìn)行滅菌處理，并在PCR擴(kuò)增過(guò)程中添加去抑制劑;（3）某些環(huán)境因子可能會(huì)對(duì)eDNA的產(chǎn)生速率或降解速率造成影響，這將直接影響到最終的DNA量和定量研究的準(zhǔn)確性，而目前仍無(wú)法完全確定哪些環(huán)境因子會(huì)影響eDNA的產(chǎn)生或降解速率，有待進(jìn)一步的研究和考證;（4）eDNA技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果在時(shí)間和空間尺度上的精度較低，其檢測(cè)精度還有待提升。

eDNA技術(shù)是以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的一種簡(jiǎn)單高效的物種監(jiān)測(cè)方法，與二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合后可展現(xiàn)出巨大的潛能。未來(lái)關(guān)于eDNA技術(shù)的研究應(yīng)涉及以下幾個(gè)方面：（1）明確影響eDNA產(chǎn)生和降解的環(huán)境因子和相應(yīng)的機(jī)理;（2）建立eDNA與生物量之間的關(guān)系模型，實(shí)現(xiàn)利用eDNA技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行定量評(píng)估;（3）對(duì)生物多樣性熱點(diǎn)地區(qū)的eDNA進(jìn)行分析，發(fā)揮并提升eDNA技術(shù)在生物多樣性保護(hù)中的作用;（4）將eDNA技術(shù)應(yīng)用到食物網(wǎng)、能量流動(dòng)等研究中，進(jìn)一步拓展其應(yīng)用的領(lǐng)域。

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