◆作者：崔細(xì)鵬 鄒嘉豪

◆單位：廣東溢多利生物科技股份有限公司，廣東飼料添加劑生物工程技術(shù)研究開發(fā)中心

植酸大量存在于植物種子和花粉中，是植物貯存磷元素的主要形式。植酸磷是一個(gè)含六個(gè)磷酸基團(tuán)的環(huán)狀化合物，因?yàn)樗绊懫渌V物元素的有效性，所以是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。以植酸磷形式存在的磷因單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏能分解植酸的酶而難以被利用，其利用率僅在0～40%。這導(dǎo)致了諸多的問題，一方面，飼料中85%左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的植酸磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。另一方面，飼料中的磷源不能得到有效利用，從而造成磷源浪費(fèi)。另外，為了滿足動(dòng)物對(duì)磷的需求，必須在飼料中添加無(wú)機(jī)磷，增加了飼料成本，而高磷糞便又增加了環(huán)境污染。

植酸酶是能夠降解植酸釋放出無(wú)機(jī)磷的一類酶的總稱。但是由于動(dòng)物和植物中的植酸酶含量很低且難以分離，加之其酶學(xué)性質(zhì)標(biāo)明不適合在單胃畜禽胃腸道中發(fā)揮作用。所以植酸酶開始轉(zhuǎn)向微生物來(lái)源的方向，從1968年開始，通過(guò)分子生物學(xué)和基因工程手段，陸續(xù)從真菌、細(xì)菌等十多種微生物中分離到植酸酶，得到了對(duì)抗蛋白酶強(qiáng)的植酸酶。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬動(dòng)物胃的環(huán)境，摸索不同植酸酶對(duì)飼料原料的分解效率，為植酸酶的應(yīng)用推廣提供可靠的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

儀器：精密 pH 計(jì)（0.01）、分析天平（0.01g）、離心機(jī)、分光光度計(jì)、恒溫振蕩水浴鍋等。

試劑：pH5.5的 0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液。pH2.0的鹽酸溶液：稱取10.36g NaCl和0.98g KCl，放入 2000mL 燒杯，加入1800mL去離子水溶解，并用2mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH 到2.0，定容至2000mL。模擬胃液：胃蛋白酶濃度為 737.5 U/mL。稱取184.38kU（千單位）的胃蛋白酶（sigma P7000） 溶解于 250mL pH2.0的鹽酸溶液中，緩慢攪拌直至溶解。臨用前配制。10%三氯乙酸溶液。

1.2 底物制備

將常用飼料原料底物小麥、玉米、豆粕、DDGS、菜粕、棕櫚粕、米糠烘干粉碎，過(guò)24目篩。

1.3 酶樣品來(lái)源

本試驗(yàn)采用的植酸酶產(chǎn)品來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同廠家的植酸酶產(chǎn)品。表1是這些酶的基本信息。

表1 植酸酶樣品酶活

1.4 試驗(yàn)步驟及測(cè)定方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（不加酶）和加酶組。

對(duì)照組：稱取10.00g底物飼料，按料∶水=1∶10（水指模擬胃液）。與酶解樣放在一起，酶解開始后，每隔1h振蕩一次，速度120r/min。酶解結(jié)束后，加入5mL 10%三氯乙酸溶液，取出酶解樣品適量4000r/min離心10min，收集上清液，待測(cè)。

加酶組：稱取10.00g底物飼料，最終添加植酸酶：1U/g原料；料∶水=1∶10（水指模擬胃液）。酶解溫度37℃，共酶解5h，酶解開始后，每隔1h振蕩一次，一次10min，速度120r/min。酶解結(jié)束后，加入5mL 10%三氯乙酸溶液，取出酶解樣品適量4000r/min離心10min，收集上清液，待測(cè)。

1.4.2 測(cè)定指標(biāo)

取適量濾液，加10mL鉬黃顯色劑，用蒸餾水定容至50mL，靜置10min后，如澄清無(wú)渾濁，直接于420 nm測(cè)定OD值(吸光度)，如靜置后出現(xiàn)渾濁，則將該混合液搖勻，取 10 mL，4000 r/min離心10min后取清液再測(cè)OD值（測(cè)定OD值在0.3～0.5，若不在此區(qū)域，需調(diào)整濾液的量）。

表2 10種植酸酶對(duì)7種飼料原料體外酶解無(wú)機(jī)磷含量的影響（μg/m L）

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算無(wú)機(jī)磷的含量（標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參考GB/T 6437-2002）。

植酸酶酶解效率=(加酶組無(wú)機(jī)磷含量-空白組無(wú)機(jī)磷含量)÷空白組無(wú)機(jī)磷含量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

結(jié)果見表2、表3。

表3 10種植酸酶對(duì)7種飼料原料體外酶解結(jié)果:無(wú)機(jī)磷含量增長(zhǎng)率（%）

2.2 分析

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)豆粕的酶解效率：8＞9＞10＞5＞6＞1＞7＞4＞3＞2；8、9、10 號(hào)植酸酶酶解效率最高，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率達(dá)到1000% 以上；2、3、4 號(hào)植酸酶酶解效率較低，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率為700%。各植酸酶對(duì)豆粕酶解效率明顯，各組之間差異顯著。

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)玉米的酶解效率：5＞9＞2＞8＞10、6＞1＞7＞3＞4；各植酸酶對(duì)玉米酶解效果明顯，5號(hào)酶解效率最高，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率為1773.8%；4號(hào)對(duì)玉米酶解效率最低，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率為1592.3%，但各組間差異不顯著。

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)小麥的酶解效率：8、9＞2＞10＞7＞6、1＞3＞4＞5；各植酸酶酶解效果對(duì)小麥不明顯，8號(hào)和9號(hào)對(duì)小麥酶解效果最好，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率達(dá)到了63.7%；5號(hào)植酸酶無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率僅僅為6.9%。但各組之間差異較顯著。

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)菜粕的酶解效率：8＞9＞10＞3＞6＞7、1＞5＞4＞2；各植酸酶酶解效果對(duì)菜粕較明顯，酶解效率最高的為8號(hào)和9號(hào)，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率分別為 230.3%和225.6%；2號(hào)酶解效率最低，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率為154.1%。各組間差異較顯著。

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)DDGS的酶解效率：8、9＞10＞5＞6＞1＞7＞4＞3＞2；各植酸酶酶解效果對(duì)DDGS較明顯，8號(hào)和9號(hào)酶解效率最高，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率分別為504.6%，各組間差異較顯著。

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)米糠的酶解效率：8＞9、10＞7＞5＞6＞1＞2＞3＞4；各植酸酶酶解效果對(duì)米糠較明顯，8號(hào)和9號(hào)酶解效果最高，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率分別為360.7%和349.2%，各組間差異較顯著。

各植酸酶產(chǎn)品對(duì)棕櫚粕的酶解效率：10＞9＞8＞5＞1＞7＞6＞4＞2＞3；各植酸酶酶解效果對(duì)菜粕較明顯，8號(hào)、9號(hào)和10號(hào)酶解效率最高，無(wú)機(jī)磷增長(zhǎng)率分別為174.6%、185.2%和186.0%，各組之間差異不顯著。

3 討論

本試驗(yàn)中的底物存在于飼料原料中，植酸與磷的結(jié)合以及植酸酶的左右滲透都需要時(shí)間；另一方面，飼料中的礦物質(zhì)大多數(shù)與植酸結(jié)合，形成不容易溶解的植酸鹽，飼料成分的各不相同使得植酸鹽的形式也各不相同，可能導(dǎo)致植酸磷利用變化較大。8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)植酸酶對(duì)蛋白原料和能量原料酶解效率在所選10種植酸酶中最佳；2號(hào)植酸酶對(duì)能量原料作用效果好，但對(duì)蛋白原料作用效果較差。其原因可能不同來(lái)源的植酸酶，分解植酸磷能力不同，抗胃蛋白酶能力不同，也會(huì)造成酶解效果的差異。

由于動(dòng)物體的消化代謝生理過(guò)程復(fù)雜，且受許多因素影響。該體外試驗(yàn)只是確定添加量為1U/g原料的情況下，研究各個(gè)廠家植酸酶在模擬胃液中對(duì)飼料底物的酶解效果，而實(shí)際的體內(nèi)效果還需要用進(jìn)一步驗(yàn)證。