王丹萍，謝夢圓，李志斌，朱文國，余健輝，陳 哲，張 軍

(暨南大學 理工學院 廣州市可見光通信重點實驗室，廣東 廣州 510632)

引言

無透鏡顯微成像系統(tǒng)是一種不需要使用任何透鏡聚光、直接使用成像傳感器對物體進行成像的系統(tǒng)。傳統(tǒng)顯微鏡成像分辨率較高(200 nm)，但是視場較小(最大約為5 mm2)[1-3]，與之相比，無透鏡顯微成像的優(yōu)點在于結構簡單，同時具有大視場。因此，現今許多研究都致力于利用無透鏡顯微成像系統(tǒng)進行細胞計數和疾病診斷[4-12]，并將之直接集成為一個醫(yī)療器件[9,11,13]。但是無透鏡顯微成像系統(tǒng)存在分辨率低的問題，一般只有幾十微米。現有的研究主要通過兩種方式提高無透鏡顯微成像系統(tǒng)的分辨率：改進實驗裝置[14-16]和改善圖像重構算法[16-19]。在改進實驗裝置方面，Mudanyali等人在待檢測樣品前插入1.1 μm起偏器，實現1.5 μm的成像分辨率[1]；在改善圖像重構算法方面，主要是將多幅圖像進行疊層處理，從而提高分辨率。如Antonio等人[2]拍攝不同角度的樣品圖片，再使用快速魯棒算法(SURF)和蟻群算法進行圖像的疊層處理，獲得了1.55 μm的圖像分辨率，突破了實驗所用complementary metal oxide semiconductor(CMOS)的分辨率極限(1.56 μm)。使用多幅無透鏡疊層算法進行圖像重構時，雖然能夠達到甚至突破CMOS本身的分辨率極限，但與單幅的無透鏡圖像重構相比，增加了圖像處理過程的復雜度，降低了成像速度。而國內對于單幅無透鏡成像算法方面的研究也較多[20-26]，但是單幅圖像的分辨率都較低，如重慶大學張德燕等人[20]制作的集成型無透鏡顯微成像系統(tǒng)的分辨率為40 μm；陳云鵬等人[25]也搭建了無透鏡顯微成像系統(tǒng)，利用angle spectrum method(ASM)算法得到的分辨率為6.96 μm。雖然單幅無透鏡顯微成像系統(tǒng)的裝置結構簡單，但是分辨率仍需進一步提高。

由于文獻[27]中，無透鏡非相干成像使用了Lucy-Richardson(簡稱L-R)算法進行圖像重構，因此，本文將對L-R算法做部分修改，將其作為無透鏡相干成像重構算法的一種，并與ASM重構結果進行對比，從而確定最佳的單幅無透鏡顯微成像重構算法。結果表明，在本無透鏡顯微成像系統(tǒng)中，ASM重構圖像的分辨率最高(即3.10 μm)，運行時間最短(即0.9 s)。同時，本文進一步利用小鼠胚胎成纖維細胞(簡稱3T3細胞)對系統(tǒng)進行了驗證。結果表明，所獲得的圖像分辨率介于5×與10×顯微鏡之間，且無透鏡顯微成像系統(tǒng)的視場比10×蔡司顯微鏡大16倍，比5×蔡司顯微鏡大4.4倍。因此無透鏡顯微成像系統(tǒng)在細胞觀察/計數方面其統(tǒng)計學優(yōu)勢明顯高于傳統(tǒng)顯微鏡，在生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。

1 實驗裝置及算法原理

1.1 實驗裝置

本文的無透鏡顯微成像系統(tǒng)裝置如圖1所示，由成像傳感器CMOS、樣品和光源組成。所用CMOS的型號為TP605100A，視場為24.4 mm2，空間分辨率為2 592×1 944像素，像素點大小為2.2 μm，幀速最快為60 fps，光源是中心波長為450 nm的藍光LED。將實驗中需要使用的樣品置于光源與CMOS之間，光源距離CMOS 320 mm，樣品與CMOS之間的距離約為1 mm。在進行圖像拍攝實驗時，將USAF分辨率板或包含細胞的計數板作為樣品，當光源發(fā)出的光透過樣品后，在CMOS表面發(fā)生衍射，由CMOS記錄圖像，獲取無透鏡拍攝的原圖。

圖1 無透鏡顯微成像系統(tǒng)的裝置圖

1.2 算法原理

L-R算法進行解卷積的原理如下：

1) 設物函數為object，物函數的振幅為objectAmp，?表示卷積，則

object=objectAmp·eiφ

(1)

(1)式表示一個物體是由振幅objectAmp以及相位φ組成。

2) 經過空間中的傳輸，獲取的圖像Im(x,y)設定為物函數object(x,y)與點擴散函數PSF(x,y)的卷積，即：

Im(x,y)=object(x,y)?PSF(x,y)

(2)

其中點擴散函數PSF為

(jλ·(x2+y2+z2))

(3)

式中：波數k=2π/λ；x,y為每個像素點對應的空間坐標；z為物和像之間的傳輸距離；λ為入射光波長。

3) 取迭代次數為i，i≥2，將獲取的圖像Im(x,y)賦值給obji(x,y)，并將圖像回傳到物面，反推物函數，反推迭代公式如下：

PSF(x,y)}·obji-1(x,y)

(4)

4) 迭代結果輸出還原的物函數的強度圖abs(obji(x,y))和相位圖ang(obji(x,y))。

由于L-R算法在迭代的過程中有濾波模糊的作用，因此迭代次數不宜過多，否則圖像丟失的信息增多導致圖像模糊不清，因此本文只使用2次迭代。

ASM重構的原理如圖2所示，x0、y0所構成的平面為物平面，x1、y1所構成的平面為記錄平面，物平面上存在某點P(x,y,0)，經過光照射后，P點在記錄平面上的投影為P′(x,y,z)。設P點的振幅為U(x,y,0)，P′點的振幅為U′(x,y,z)，P的空間頻譜為A(fx,fy,0)，P′的空間頻譜為A′(fx,fy,z)。fx是對應像素點的頻譜橫坐標，fy是對應像素點的頻譜縱坐標。具體計算過程如下：

圖2 ASM重構的原理圖

1)P′的振幅U′(x,y,z)可表示為

fyy)]dfxdfy

(5)

由標量衍射理論在平面波傳播中的推導可得[28]：

(6)

2) 對比(5)式和(6)式可得，P′的空間頻譜A′(fx,fy,z)可表示為

(7)

3) 通過(7)式可得波傳播的傳遞函數H可表示為

(8)

4) 在離散條件下，再現物P點的空間振幅u(x,y,0)可以表示為

u(x,y,0)=IFT(FT(u(x,y,z))×

H(fx,fy))

(9)

同理，再現物P點對應的空間振幅u可輸出物點的強度圖abs(u(x,y,0))和相位圖ang(a(x,y,0))。

2 實驗結果

2.1 分辨率分析

圖3為無透鏡顯微成像系統(tǒng)拍攝的分辨率板原圖及L-R算法重構后的結果。

圖3 無透鏡顯微成像系統(tǒng)拍攝的分辨率板原圖及L-R算法重構后的結果

由圖3(a)可得，無透鏡拍攝原圖的分辨率為12.40 μm(組5元素3)，原圖中組5 元素4及后面的元素由于振鈴效應，圖中出現4條紋及或2條紋，因此需要使用重構算法來消除和減弱振鈴效應，提高圖像的分辨率。圖3(b)和圖3(c)是圖3(a)經過L-R算法重構后得到的振幅圖和相位圖。由圖3(b)可知， L-R算法重構所得振幅圖分辨率為11.05 μm(組5 元素4)；由圖3(c)可得， L-R算法重構的相位圖分辨率為6.96 μm(組6元素2)。由此可知，L-R算法重構時，在一定程度上減弱了振鈴效應，提高了分辨率。

圖4為無透鏡顯微成像系統(tǒng)拍攝的原圖及ASM重構的結果，其中圖4(a)是無透鏡顯微成像系統(tǒng)拍攝的原始圖像，圖4(b)和圖4(c)分別為經過ASM重構所得的振幅圖和相位圖。由圖4(c)可知，相位圖中的振鈴效應沒有任何改善，分辨率仍為12.40 μm(組5元素3)；圖4(b)的振幅圖在很大程度上減弱了振鈴效應，使圖像得到復原，但是具體分辨率仍需進一步分析。

圖4 無透鏡顯微成像系統(tǒng)拍攝的原圖及ASM重構的結果

為了對圖4(b)的分辨率做出科學的判斷，本文將瑞利判據作為極限分辨率的判斷依據。由于圖4(b)中組6元素及組7元素1已清晰可辨，本節(jié)將針對圖4(b)的組7 元素2(豎向元素)、組7元素3(包括豎向元素和橫向元素)和組7元素4(橫向元素)，取1行/列像素點(針對豎/橫向元素)，圖5(a)中分別用粗實線、粗虛線、細實線和細虛線4條畫線表示。4條畫線對應的像素點與灰度值的關系曲線分別如圖5(b)、(c)、(d)、(e)所示。對比圖5(b)～(e)，根據瑞利判據，兩個波峰相交的波谷對應的值所占波峰值的73.7%以下屬于可分辨。由此可得：組7元素2和組7元素3(橫向元素)可以分辨；組7元素 3(豎向元素)和組7元素4不可分辨。因此無透鏡顯微成像系統(tǒng)結合ASM的方法，可以獲得水平方向為3.48 μm(組7元素2)和垂直方向為3.10 μm(組7元素3)的分辨率。因此，ASM算法獲得的振幅圖分辨率為3.10 μm，即在本無透鏡顯微成像系統(tǒng)裝置中，單幅圖像的極限分辨率為3.10 μm。

圖5 (a)為對應圖4(b)中第6級和第7級元素的放大;(b)、(c)、(d)、(e)分別為(a)中粗實線、粗虛線、細實線、細虛線上的像素點與灰度值的關系曲線

綜上所述，當使用L-R算法進行圖像重構時，振幅圖的分辨率為11.05 μm，相位圖的分辨率為6.96 μm；ASM進行圖像重構后，振幅圖的分辨率為3.10 μm，相位圖的分辨率12.40 μm。由此可得，ASM重構圖像分辨率最高，為3.10 μm。同時，L-R算法的運行時間為3 h，ASM算法僅為0.9 s。因此，無論是在分辨率還是在計算用時方面，ASM都優(yōu)于L-R算法，為最佳的單幅無透鏡圖像重構算法。由于一般細胞大小約為十幾個微米，而本無透鏡顯微成像系統(tǒng)的極限分辨率為3.10 μm，因此可將無透鏡顯微成像系統(tǒng)替代傳統(tǒng)顯微鏡進行細胞成像，實現細胞實時觀察。

2.2 細胞觀察

本節(jié)利用無透鏡顯微成像系統(tǒng)對小鼠胚胎成纖維細胞(3T3細胞)進行觀察。圖6是無透鏡顯微成像系統(tǒng)拍攝的包含3T3細胞的細胞計數板圖像及使用ASM重構后的結果。由于無透鏡成像系統(tǒng)的視場大小取決于CMOS的成像面積，所以該系統(tǒng)的視場與COMS的視場大小一致，為24.4 mm2。使用10×蔡司顯微鏡(AxioCam MRc 5)的視場大小約為1.5 mm2，5×蔡司顯微鏡的視場大小約為5.6 mm2；使用分辨率板標定的10×蔡司顯微鏡的分辨率約為2.19 μm，5×蔡司顯微鏡的分辨率為3.91 μm。由此可得，無透鏡顯微成像系統(tǒng)結合ASM算法進行圖像重構時，所得圖像的分辨率介于5×與10×顯微鏡之間，且無透鏡顯微成像系統(tǒng)的視場尺寸比10×蔡司顯微鏡大16倍，比5×蔡司顯微鏡大4.4倍。在細胞計數方面，顯微觀察時視場越大，計數會更加準確(更具有統(tǒng)計學意義)，因此在使用傳統(tǒng)顯微鏡進行細胞計數時，一般選用低倍顯微鏡以獲得大視場。本無透鏡顯微成像系統(tǒng)結合ASM所獲取圖像的分辨率比5×顯微鏡高，同時視場是5×顯微鏡的4.4倍，因此無透鏡顯微成像系統(tǒng)在細胞觀察/計數方面其統(tǒng)計學優(yōu)勢高于傳統(tǒng)顯微鏡。除此之外，該無透鏡顯微成像系統(tǒng)結構簡單，經過光學設計后，其高度可減小為十幾個厘米，更有利于將其放入CO2細胞培養(yǎng)箱中，對細胞的生長進行實時觀察，并集成為便攜式醫(yī)療器械。

圖6 無透鏡拍攝的細胞經過ASM解卷積的結果

3 結論

本文介紹了一種無透鏡顯微成像系統(tǒng)，并針對單幅無透鏡顯微圖像的重構算法進行研究，分別使用了L-R和ASM兩種算法進行圖像重構。其中L-R算法重構所得的振幅圖分辨率為11.05 μm，相位圖分辨率為6.96 μm，運行時間3.0 h；ASM算法獲得的振幅圖分辨率為3.10 μm，相位圖分辨率12.40 μm，運行時間0.9 s。因此，無論是在分辨率還是在計算用時方面，ASM均為最佳的單幅無透鏡顯微重構算法，單幅圖像的極限分辨率為3.10 μm。同時利用無透鏡顯微成像系統(tǒng)結合ASM重構的方法，對小含有鼠3T3細胞的細胞計數板進行顯微成像。所獲得的無透鏡圖像分辨率介于5×與10×顯微鏡之間，同時視場是5×顯微鏡的4.4倍。因此無透鏡顯微成像系統(tǒng)在細胞觀察/計數方面優(yōu)于傳統(tǒng)顯微鏡，統(tǒng)計學優(yōu)勢明顯。本文無透鏡顯微成像系統(tǒng)結合ASM算法進行圖像重構的方法，不僅能夠實現更高的分辨率，還具有更大的視場，在生物醫(yī)學領域具有廣闊的應用前景。