任清長 郁馮艷 付佳偉 華金玲

摘 要：目的：添加甘油、蔗糖、葡萄糖、蛋黃作為纖維分解菌冷凍干燥的保護劑，篩選最有利于纖維分解菌冷凍干燥保存的保護劑，為優(yōu)化纖維分解菌冷凍干燥低溫保存保護劑提供參考。方法：添加甘油、蔗糖、葡萄糖、蛋黃作為4個試驗組，添加量均為10%，每個試驗組3個重復，同時設置1個不含保護劑的空白對照組。預凍時間設為12h和24h，采用羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基與稀釋至107級的菌懸液混勻的方法培養(yǎng)冷凍干燥處理前后的纖維分解菌，37℃培養(yǎng)12h，觀察處理前后每個培養(yǎng)皿中單個菌落數并計數。結果：預凍時間為12h，甘油處理組、空白對照組與蛋黃處理組、葡萄糖處理組、蔗糖處理組間差異極顯著（P<0.01），甘油處理組與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01）;預凍時間為24h，蔗糖處理與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01），蛋黃處理與蔗糖處理、甘油處理、空白對照組間差異極顯著（P<0.01）。結論：預凍時間為12h和24h，均以蛋黃處理組的復活率最高，不加保護劑的復活率最低。隨著預凍時間的延長，每個不同處理組的復活率都有所減小。預凍時間12h，蛋黃處理組的復活率在試驗中最高，保護效果最好。

關鍵詞：纖維分解菌;保護劑;預凍時間;復活率

中圖分類號 S476文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）16-0025-04

Abstract：Objective the purpose of this study is to add glycerol，sucrose，glucose，egg yolk as cellulose decomposition microbes freeze-drying protectant，searching for the most in favor of preservation of cellulose decomposition microbes freeze-drying protectant，to optimize the screening of cellulose decomposition microbes freeze-drying kept at low temperature protective agent to provide the reference.Methods Add glycerol，sucrose，glucose，egg yolk，as four patients，content are all 10%，each group sets three repeats，setting up a blank control group without protective agent，at the same time.prefreezing time set to 12 hours and 24 hours，using sodium carboxymethyl cellulose semisolid culture medium with bacteria suspension diluted to level 107 blending method of training before and after freeze-drying process of cellulose decomposition microbes，developing 12 hours in 37℃.Observe individual colony forming units of each group before and after dealing and count..ResultsUse the semisolid colony counting method to measure the solid medium prefreezing time of 12 hours glycerin treatment group，blank control group with egg yolk treatment group，glucose，sucrose extremely significant difference between groups（P<0.01），glycerin significant difference between treatment group and the blank control group （0.05>P>0.01）.Prefreezing time for 24 hours cane sugar processing and significant difference between the blank control group （0.05>P>0.01），the egg yolk with sucrose，glycerol，and extremely significant difference between the blank control group （P<0.01）.Conclusion Prefreezingtime of 12 hours and 24 hours，the resurrection rate of the egg yolk treatment group is the highest，the resurrection rate without protective agent is the lowest.The resurrection rate of each treatment group decreases with the increasing of the prefreezing time.Prefreezingtime of 12 hours，the resurrection rate of the egg yolk treatment group is the highest in this study.Thus，the protective effect of egg yolk is the best in four protective agents.

Key words：Cellulose decomposition microbes;Protective agent;Prefreezing time;Resurrection rate

秸稈不僅是農作物的主要副產品，也是十分寶貴的生物資源[1]，如果不合理利用，將會造成資源浪費，甚至有會造成環(huán)境污染，若利用合理，則變廢為寶，實現秸稈的經濟、環(huán)境及社會效益[2]。秸稈當中所含的主要營養(yǎng)物質是粗纖維，由于很難被動物消化，因而主要飼喂牛羊。纖維分解菌分泌的纖維素酶，能夠有效地降解秸稈中的木質纖維素并轉化成葡萄糖，從而能夠被動物機體所吸收[3]。將生物活性強的纖維分解菌添加到秸稈當中制成發(fā)酵飼料，秸稈就能夠更好地為反芻動物所消化吸收，從而充分地利用了秸稈資源，提高了飼料資源的利用效率，降低環(huán)境污染的程度。但纖維分解菌用于制作秸稈發(fā)酵飼料，也存在著活菌如何長期保存以便發(fā)酵飼料生產的問題。

據國內相關研究報道，用于保存菌種最有效的方法是真空冷凍干燥法[4]，為了避免菌種在冷凍干燥過程中受冷凍和干燥2種刺激的作用[5]，必須添加有效的保護劑來承受這2種刺激的損害，降低對菌體細胞的破壞，而且復水[6]后還具有較高的降解纖維素的能力。為此，本試驗通過添加蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黃4種不同的保護劑，研究各自對纖維分解菌冷凍干燥的作用，從而篩選出最有利于纖維分解菌冷凍保存的保護劑，以期為優(yōu)化纖維分解菌冷凍干燥保存中保護劑提供參考，為纖維分解菌發(fā)酵飼料的生產工藝研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥品及菌種 脫脂乳粉、蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黃、羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基、1株纖維分解菌（實驗室保留的菌種）。

1.2 試驗設計 添加蔗糖、葡萄糖、甘油、蛋黃4種保護劑，添加量均為10%，每種保護劑做3個重復試驗組，同時設定1個不加保護劑的空白對照組。將羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基與處理前后稀釋至107級的1mL菌液稀釋液，在50℃條件下混勻，37℃培養(yǎng)12h，觀察生成的單個菌落數。用處理后的單個菌落數除以處理前單個菌落數的方法計算出每種保護劑的復活率，用復活率值的大小來評價每種保護劑的作用。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖維分解菌的純化、篩選和鑒別 （1）實驗室保留的纖維分解菌經初篩后，改用羧甲基纖維素鈉復篩培養(yǎng)基[7]分離純化，剛果紅培養(yǎng)基鑒別，挑取透明圈內的單個菌落，再次接種到復篩培養(yǎng)基上進行純化。反復純化過后的菌種經革蘭染色，鏡檢觀察，結果被染成藍紫色，菌體呈短桿狀，可初步判定為纖維分解菌。（2）纖維分解菌的形態(tài)學觀察：詳見圖1、圖2。

1.3.2 纖維分解菌菌懸液的制備 （1）脫脂乳的制備：從網上購買進口新鮮的脫脂乳粉，按照脫脂乳粉∶蒸餾水=3∶22的比例配成12%的脫脂乳。（2）菌懸液的制備：接種環(huán)挑取3～4個生長良好的纖維分解菌平板，接到100mL滅菌后的脫脂乳中。將接好菌的脫脂乳置于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)搖晃過夜制成生長均勻的菌懸液。

1.3.3 處理前菌懸液活菌數的測定

1.3.3.1 處理前菌懸液的稀釋 （1）取出振蕩過夜的菌懸液，放在滅菌后的無菌操作臺上，用移液槍分別從菌懸液的上、中、下3層取出10ul菌液。（2）每層取出的菌液均加到裝有10mL生理鹽水的管子中，上下顛倒管子使其混合均勻。再取混合好的稀釋液10ul到另1個10mL生理鹽水管子中，混勻。（3）取混勻后的稀釋液1mL，加到9mL生理鹽水的管子中，混合均勻，將原菌懸液稀釋至107級。

1.3.3.2 羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基 Na2HPO41.25g，KH2PO40.75g，CMC-Na10g，酵母提取物0.25g，蛋白胨1.25g，瓊脂條2.5g，蒸餾水500mL，pH7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

1.3.3.3 稀釋后菌懸液的接種與培養(yǎng)后菌落計數 （1）移取最終的原菌液稀釋液1mL，加在培養(yǎng)皿底部，輕輕搖晃平皿，讓稀釋液均勻地鋪滿整個培養(yǎng)皿的底部。（2）待半固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃以下時，開始往平皿底部倒入適量半固體培養(yǎng)基。用移液槍的槍頭順時針攪拌使其混合均勻，并防止氣泡產生而影響觀察?；旌暇鶆蚝?，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。（3）觀察培養(yǎng)后的平板中目標菌的菌落生長情況，并記錄下每層所生成的單個菌落數，取其平均值作為處理之前10μL原菌液當中的活菌數。

1.3.4 原菌懸液凍干保護劑的添加 （1）安瓿管及保護劑的預處理：安瓿管先用1%的鹽酸浸泡30min，再用清水洗凈，經121℃高壓蒸汽滅菌20min后，置于烘箱中備用。蔗糖、葡萄糖固體藥品按量稱好后開紫外燈殺菌10min，甘油進行121℃高壓蒸汽滅菌處理，選用新鮮且無任何病原菌的雞蛋，取出蛋黃打均勻后，開紫外燈殺菌10min。（2）固體保護劑的添加：稱取預處理好的蔗糖、葡萄糖各0.05g，移液槍吸取菌液0.5mL，在紫外線照射過的塑料手套上混合后，加入到安瓿管中，并塞進滅菌的脫脂棉。（3）液體保護劑的添加：甘油和蛋黃都取50μL，同上與菌液混合均勻后，加到安瓿管中，塞好脫脂棉。

1.3.5 試樣的冷凍干燥保存 （1）試樣的預凍處理：裝好保護劑與菌液的安瓿管試樣，連同不加保護劑的空白樣共同放在一個無菌的自封袋中，置于-80℃冰箱中做預凍處理。（2）試樣的冷凍干燥：①冷凍干燥機用前開機預凍30min，待冷肼內的溫度達到-55℃后，將樣品放在物料盤上，加入1支氯化鈷指示劑，蓋好有機玻璃罩，打開真空泵，進行抽真空，時間為18～20h。②待氯化鈷指示劑由紅色變成藍色時，判定樣品中的水分已干。此時可觀察到樣品已成干粉狀，即關閉真空泵，關閉干燥機電源，打開玻璃罩，將樣品取出。（3）封管：用坩堝鉗夾住安瓿管的球形底部，鑷子夾住管頭，將管子的細部置于酒精噴燈火焰上。讓其燒斷，并用鑷子夾癟燒斷處，使其成鴨嘴狀便可。（4）保存：封管后的樣品放到-80℃冰箱中，進行長期低溫保存。

1.3.6 菌凍干粉的復活 （1）菌凍干粉的復活：①將保存在-80℃冰箱中的凍干粉樣品取出，放進一個鐵試管架上，在操作臺上靜置5min。②小心地敲碎封管口，用移液槍吸取500μL的滅菌蒸餾水，加入到每支管中，手腕輕輕搖動，直至凍干粉溶解成液態(tài)，達到凍干前體積。③待所有管子加完蒸餾水后，再次塞好脫脂棉，靜置復活1～2h。（2）復活后菌液的稀釋與培養(yǎng)：①用移液槍從每支安瓿管中取出10μL菌液按處理前菌液的稀釋方法進行稀釋，最終稀釋好的樣品做好相應的標記。②按照處理前與羧甲基纖維素鈉半固體培養(yǎng)基混勻的方法對其進行接種，待其凝固后倒扣平板，在37℃培養(yǎng)箱中同樣培養(yǎng)12h。③等到培養(yǎng)時間完成，進行菌落形態(tài)的觀察，數出每個平板當中的單個菌落數，對應上每種保護劑，并做好記錄。（3）根據下面公式計算出纖維分解菌冷凍干燥后的復活率：

復活率（%）=[處理后10μL菌液稀釋培養(yǎng)生成的單個菌落數處理前10μL菌液稀釋培養(yǎng)生成的單個菌落數]×100

1.4 數據處理 數據采用Excel和SPASS 19.0軟件進行處理，并進行Duncan法多重比較。結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 保護劑對纖維分解菌冷凍干燥的影響 從表1可以看出，當預凍時間為12h，甘油處理組、空白對照組與蛋黃處理組、葡萄糖處理組、蔗糖處理組間差異極顯著（P<0.01），甘油處理組與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01），蛋黃處理組與葡萄糖處理組、蔗糖處理組間差異不顯著（P>0.05）。其中，添加蛋黃處理組的復活率最高，不加保護劑處理組的復活率最低。葡萄糖處理組、蔗糖處理組比蛋黃處理組的復活率都低13.3%;甘油處理組比蛋黃處理組、葡萄糖處理組、蔗糖處理組的復活率分別低50.0%、42.4%、42.3%;空白對照組比甘油處理組的復活率低46.8%，不同處理組間的復活率由高到低的順序為蛋黃>葡萄糖>蔗糖>甘油>空白對照組。預凍時間為24h，蛋黃處理與葡萄糖處理組，葡萄糖處理與蔗糖處理、甘油處理組，甘油處理與空白對照組間差異不顯著（P>0.05），蔗糖處理與空白對照組間差異顯著（0.05>P>0.01），蛋黃處理與蔗糖處理、甘油處理、空白對照組間差異極顯著（P<0.01）。處理組間仍以蛋黃的復活率最高，不加保護劑的最低，且不同處理組間的復活率由高到低的順序仍與12h的相同。

2.2 預凍時間對纖維分解菌冷凍干燥的影響 從表1可以看出，蛋黃處理組、甘油處理組預凍時間12h與24h的復活率差異不顯著（P>0.05），葡萄糖處理組、空白對照組預凍時間12h與24h的復活率差異顯著（0.05>P>0.01），蔗糖處理組預凍時間12h與24h的復活率差異極顯著（P<0.01）。24h的蛋黃處理比12h的處理復活率降低了26.7%，其他處理組24h與12h的復活率相比均有所降低。其中以蔗糖處理組的復活率下降最大，24h的復活率較12h的降低55.9%。

3 討論

3.1 保護劑 舒志全等研究蛋黃和海藻糖在人類精子冷凍保存中的保存作用時發(fā)現，蛋黃與海藻糖組合作為保護劑時，能夠對精子起到更好的保護作用[8]。蛋黃不僅能減少精子細胞在預凍降溫過程中受到的損傷，同時還能作為大分子物質，在凍干過程中提供框架結構，形成多孔介質。蛋黃作為保護劑，特別是深低溫冷凍保存中具有極高的保護作用[9]。試驗預凍時間12h和24h的不同處理組間，蛋黃作為保護劑時，其復活率都是最高的。這可能是由于蛋白質作為大分子物質，與菌體表面的自由基結合形成氫鍵以取代水，從而減少了游離水的含量，提高菌液的粘性，減緩了冰晶生長的過程，使冰晶變得細小，因此就起到了保護菌體細胞的作用[10]。脫脂乳粉主要是在細胞表面起保護作用，需要和其它類型保護劑混合使用效果才更好，甘油能夠滲透到細胞內部，使細胞壁的通透性降低，從而對細胞起到很好的保護作用[11]。試驗脫脂乳的空白對照組在所有的處理組間復活率最低，預凍時間12h甘油處理組與空白照組間的復活率差異顯著（0.05>P>0.01）。此試驗的結果與相關研究的規(guī)律基本符合。蒲麗麗等研究中提到糖類物質具有大量羥基，能聯結菌周圍的自由基團，可避免菌暴露在介質中[12]。因此，蔗糖處理組與葡萄糖處理組的復活率都很高，接近40%;這與吳玲等在研究瑞士乳桿菌凍干保護劑的選擇時，蔗糖處理組的復活率44%接近，但其葡萄糖處理組的復活率高達75%，顯著高于此試驗中葡萄糖處理組的復活率[13]?？赡苁潜驹囼炘谄咸烟堑奶砑恿可吓c之有所差別，或者是葡萄糖本身的品質較差所致。

3.2 預凍時間 張帆等在對雙歧桿菌凍干菌粉制備工藝的研究中發(fā)現，當預凍溫度一定時，隨著預凍時間的增加，細菌的存活率整體呈下降的趨勢[14]，試驗預凍時間12h，不同處理組的復活率都較24h的復活率高。這可能是因為預凍時間過長，低溫進一步破壞了保護劑，使得其保護效果下降。張志平等研究中提到冷凍平衡時間的延長，精子的活力呈下降趨勢，以冷凍前平衡1h為宜[15]，這與試驗結果基本吻合。Zindl等在冷凍狼精液中發(fā)現，以平衡1h為宜，平衡時間過長會損害精子的完整性[16]。試驗預凍時間24h各處理組的復活率要顯著低于12h的，說明預凍時間不應過長，而最佳的預凍時間可能介于12～24h，或者低于12h。這就需要設置多個預凍時間梯度，找出最佳的預凍時間，從而提高纖維分解菌冷凍干燥的復活率。

4 結論

本試驗結果表明，蛋黃、蔗糖、葡萄糖、甘油4種保護劑在纖維分解菌冷凍干燥過程中均具有顯著的保護作用。預凍時間為12h和24h，均以添加蛋黃處理組的復活率最高，不加保護劑處理組的復活率最低。隨著預凍時間的延長，各處理組的復活率均有所下降，其中蔗糖處理組的復活率下降最顯著。預凍時間以12h時，蛋黃處理組的復活效果最好，因此，4種保護劑中保護效果最好的是蛋黃。

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（責編：張宏民）