張一楓，竇 森，葉淑芬，張丹丹

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

玉米秸稈作為普遍存在的農(nóng)業(yè)固體廢棄物，是研究腐殖化的原材料的重點(diǎn)對(duì)象，而其作為木質(zhì)纖維素材料有著可再生且成本低的優(yōu)勢(shì)。玉米秸稈的分解及有效轉(zhuǎn)化在全球碳循環(huán)中起著重要作用。而腐殖物質(zhì)（Humus substances，HS）是腐殖化過(guò)程的最終產(chǎn)物，秸稈好氧堆肥的腐殖化過(guò)程與土壤腐殖化過(guò)程相近，是最典型的腐殖化過(guò)程[1]。作為一種環(huán)境友好型技術(shù)，堆肥也是農(nóng)業(yè)殘留物處理的最佳方法之一，可以實(shí)現(xiàn)高效的生物轉(zhuǎn)化[2]，是農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品可持續(xù)管理的重要解決方案[3]。

土壤HS具有不同于其形成前體的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)特征的“特異性”[4]，是經(jīng)腐殖化作用形成的、具有特異性的、多相分布的類高分子化合物[5]。在最為廣泛認(rèn)可的Schulten等[6]提出的模型中，土壤胡敏酸（Humic acid，HA）是由長(zhǎng)鏈脂族結(jié)構(gòu)鏈接多個(gè)芳香環(huán)而形成，在芳香環(huán)和脂族側(cè)鏈上還存在許多由羥基和羧基所構(gòu)成的活性官能團(tuán)組[7]。但與長(zhǎng)期腐殖化的土壤相比，堆肥腐殖化的水平是較低的，相較于土壤中“成熟”的胡敏酸，秸稈堆肥中的類胡敏酸相對(duì)“稚嫩”[8-9]，但其中含有大量含氧基團(tuán)，如羧基、酚羥基、醇羥基、甲氧基和醌基等[10]。在類胡敏酸的分析中，Genevini等[11]曾提出類胡敏酸通常分為類胡敏酸（Humic acid-like，HAL）和核心類胡敏酸（Core-humic acid-like，cHAL）2種。cHAL相比HAL是去除了脂類物質(zhì)后得到的胡敏酸。關(guān)于腐殖質(zhì)的形成過(guò)程，比較盛行的是多酚理論，即土壤有機(jī)質(zhì)首先經(jīng)微生物作用，分解為簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物，例如保留原來(lái)芳香結(jié)構(gòu)的多元酚類，成為腐殖質(zhì)組成的結(jié)構(gòu)單元，在酶的作用下，將多元酚氧化為醌[12]，醌與含氮化合物等縮合成為腐殖質(zhì)。許多學(xué)者曾對(duì)此進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)真菌可以有效將木質(zhì)素與纖維素降解轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步形成醌型化合物[13]。

玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素構(gòu)成，上述三種成分之間存在各種化學(xué)鍵，共同構(gòu)成植物細(xì)胞壁，最終變?yōu)殡y降解物質(zhì)[14]。通常在秸稈堆肥過(guò)程中，真菌對(duì)上述三種成分都有較為強(qiáng)力的分解作用，對(duì)玉米秸稈的礦化分解起著重要作用。在土壤有機(jī)質(zhì)中，真菌作為K策略的微生物主要分解難降解的有機(jī)質(zhì)，而細(xì)菌作為r策略微生物更喜歡利用活性有機(jī)質(zhì)[15]。微生物的死亡殘?bào)w、代謝產(chǎn)物（如胞外酶、胞外多聚物等）或殘留物（如幾丁質(zhì)、肽聚糖等）也均屬于較難分解的有機(jī)質(zhì)[16]，植物殘?bào)w可以這些形式徹底被轉(zhuǎn)化為土壤有機(jī)質(zhì)。真菌的生物體因更難分解而對(duì)土壤的有機(jī)庫(kù)貢獻(xiàn)更高。故使用真菌進(jìn)行模擬腐殖化，對(duì)達(dá)到植物殘?bào)w的利用效益最大化更加值得研究。木霉菌是有益真菌，可以促進(jìn)有機(jī)廢物利用，且對(duì)環(huán)境無(wú)危害性[17]。里氏木霉（Trichoderma reesei）具有出色的木質(zhì)纖維素酶的生產(chǎn)能力[18-19]。如果選用里氏木霉這種對(duì)玉米秸稈分解礦化表現(xiàn)卓越的真菌，進(jìn)行腐殖化培養(yǎng)，腐殖化進(jìn)程是否能夠被高效促進(jìn)？其培養(yǎng)產(chǎn)物類腐殖質(zhì)（Humic-like substances,HLS）的堿提取物——類胡敏酸的結(jié)構(gòu)特征與土壤胡敏酸有著怎樣的差異呢？是否同樣具有特異性？

針對(duì)上述疑問(wèn)，本研究選擇了對(duì)玉米秸稈的木質(zhì)纖維素綜合利用能力較強(qiáng)的真菌：里氏木霉（Trichoderma reesei），通過(guò)固體好氧發(fā)酵的方式進(jìn)行為期30 d的腐殖化培養(yǎng)，在培養(yǎng)的0、15、30 d采樣觀察研究。通過(guò)元素組成、紅外光譜及差熱手段進(jìn)行分析真菌利用玉米秸稈得到的類腐殖質(zhì)的堿提取物——類胡敏酸，與土壤的胡敏酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。以期為闡明真菌培養(yǎng)玉米秸稈得到的HAL的結(jié)構(gòu)特異性以及真菌能否高效促進(jìn)腐殖化進(jìn)程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 玉米秸稈樣品概況

采樣地點(diǎn)：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田玉米連作耕地（43°48′43.57″N，125°23′38.50″E）。采樣地點(diǎn)屬于北溫帶大陸性半濕潤(rùn)季風(fēng)性氣候，春秋干旱多風(fēng)，夏短多雨，冬長(zhǎng)寒冷。溫度最高月份為7月，平均23℃，年均溫度為4.8℃，年均日照時(shí)間為2678 h，年均降水量為618 mm，多集中在7、8月。采樣地點(diǎn)的土壤為半濕溫半淋溶土亞綱黑土類，也就是所謂的黏淀濕潤(rùn)軟土（Argiudolls），含碳量為12.31 g·kg-1，C/N為9.84，于2017年10月4日采集土壤樣品，且研究對(duì)比所用的土壤HA由該土壤制備。

采樣的玉米秸稈植株品種為中金368（采購(gòu)來(lái)源為北京金粒粒金種子有限公司），玉米種子于2017年4月底播種，10月初收獲，基本性質(zhì)為：秸稈有機(jī)碳376.4 g·kg-1，全氮為 7.44 g·kg-1，全磷 7.7 g·kg-1，全鉀4.5 g·kg-1，C/N為61.8。實(shí)驗(yàn)用玉米秸稈于2017年10月4日采集，然后自然晾干并粉碎至0.5 cm。

1.1.2 供試微生物及微生物菌液的制備

里氏木霉（T.reesei）MCG77購(gòu)買于ATCC（American Type Cilture Collection）。

首先制取菌絲，將里氏木霉接種在固體斜面試管中，內(nèi)含30 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。將接種好的試管放在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，即制備成功，得到成熟菌絲。向試管中加入2 mL無(wú)菌水，振蕩2 min，制取菌液，將上述液體轉(zhuǎn)移到滅菌試管中。通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算濃度并稀釋，制成孢子濃度為1×107個(gè)·mL-1的孢子懸液，最后將菌液加入至PDA液體培養(yǎng)基中，以1∶10的比例接種，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)6 d，得到含有孢團(tuán)菌絲體的菌液。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g·L-1，煮沸30 min并過(guò)濾，葡萄糖：20 g·L-1，瓊脂：20 g·L-1。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g·L-1，煮沸30 min并過(guò)濾，葡萄糖：20 g·L-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 腐殖化培養(yǎng)

培養(yǎng)組：將25 g秸稈粉末加入到三角瓶中后密封。置于滅菌鍋中進(jìn)行滅菌處理，參數(shù)設(shè)定：溫度121℃，時(shí)間40 min。經(jīng)過(guò)滅菌處理后，待溫度下降至30℃開始加入菌液和無(wú)機(jī)礦物鹽培養(yǎng)液（菌液10 mL、無(wú)機(jī)鹽62.5 mL），用無(wú)菌透氣性封口膜封口（能夠保證空氣交換且不會(huì)有外界粉塵進(jìn)入），置于恒溫振蕩搖床上進(jìn)行好氧發(fā)酵培養(yǎng)。

對(duì)照組：以滅菌后加入無(wú)機(jī)鹽、不添加菌液的處理作為空白對(duì)照CK。

試驗(yàn)采用G-G 17三角瓶，容積為500 mL。

恒溫振蕩搖床設(shè)定參數(shù)：溫度30℃；轉(zhuǎn)速180 r·min-（1以達(dá)到充分振蕩通氣的目的）。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液含有：（NH2）2CO 4.2 g·L-1，（NH4）2SO419.6 g·L-1，CaCl20.028 g·L-1，KH2PO428 g·L-1，MgSO44.2 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.07 g·L-1，MnSO40.021 g·L-1，ZnSO40.019 g·L-1，CoCl24.2 g·L-1，酵母膏 7 g·L-1，pH=5。

1.2.2 樣品采集

將腐殖化培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為0、15、30 d，共3組，每組時(shí)間設(shè)3個(gè)重復(fù)。

到培養(yǎng)時(shí)間后，分別將樣品取出，在55℃條件下干燥、粉碎并混勻，全部過(guò)0.25 mm篩后備用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 類腐殖質(zhì)的提取分組

參照土壤腐殖質(zhì)組成修改法[20]，從玉米秸稈培養(yǎng)樣品中提取類富里酸（FAL）、類胡敏酸（HAL）和類胡敏素（HLM）。通過(guò)重鉻酸鉀氧化法[21]對(duì)玉米秸稈的總有機(jī)碳含量（TOC）及各組分的含碳量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算HAL的相對(duì)含量以及其在類腐殖質(zhì)中所占比例（PQ值）。

HAL組分相對(duì)含量為該組分的有機(jī)碳含量占玉米秸稈TOC的百分比：

HAL=HAL（g·kg-1）/TOC（g·kg-1）×100%

PQ值的計(jì)算公式：

PQ=HAL（g· kg-1）/[HAL（g· kg-1）+FAL（g· kg-1）]×100%

比較所用的土壤腐殖質(zhì)提取分組方法同上。

1.3.2 類胡敏酸的提取與純化

腐殖化產(chǎn)物HLS中的堿提取物HAL：提取純化根據(jù)國(guó)際腐殖質(zhì)協(xié)會(huì)推薦方法操作[22]，具體步驟為：將烘干后的秸稈樣品稱量2.5 g加入離心管中，加入1 mol·L-1HCl溶液靜置 1 h 后用濃度為 0.1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)固液比為1∶10。在25℃室溫條件下振蕩離心管6次，每次約10 min，然后低速離心棄上清液，在離心管中加入0.1 mol·L-1NaOH溶液至固液比為1∶10，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH為13～14，立即向離心管中充大約30 s N2并密封。在25℃室溫下振蕩，1次·h-1，12次后靜置過(guò)夜。靜置過(guò)夜后低速離心保留上清液HLE（Humus-like extracted），以上堿提取過(guò)程重復(fù)3次。用6 mol·L-1HCl將HLE調(diào)節(jié)至pH為1～2，靜置過(guò)夜后低速離心沉淀即為HAL。用較少量的0.1 mol·L-1KOH溶解沉淀，加入KCl使K離子濃度達(dá)到0.3 mol·L-1，靜置1 h后高速離心去除懸浮物，用6 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH=1.0，靜置12～16 h，高速離心棄上清液得到沉淀為HAL，用 0.1 mol·L-1HCl與 0.3 mol·L-1HF混合溶液酸洗HAL，次日經(jīng)高速離心棄掉上清液，上述混合酸洗過(guò)程共重復(fù)3次。酸洗完成后，將離心管中沉淀電滲析至無(wú)Cl-（AgNO3檢測(cè)），經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，凍干，得到最終純化的HAL干樣品。

比較所用的土壤HA的提取純化方法同上。

1.3.3 結(jié)構(gòu)特征分析測(cè)定方法

元素組成：采用德產(chǎn)Vario ELIII型元素分析儀測(cè)定，在C/H/N模式下進(jìn)行測(cè)量，用差熱分析中計(jì)算出的水分和灰分對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，其中C、H、N元素含量為實(shí)測(cè)值，O+S元素含量采用差減法計(jì)算。

熱穩(wěn)定性：采用日本島津TA-60型熱重分析儀測(cè)定，稱取樣品量為5～7 mg，在60 mL·min-1的空氣流量條件下，以15℃·min-1的升溫速率由35℃升至700℃。使用儀器自帶軟件來(lái)進(jìn)行差熱分析（Differential Thermal Analysis，DTA）和熱重分析（Thermo Gravimetric Analysis，TG或TGA）。

紅外光譜：采用KBr壓片法，在美國(guó)Nicolet AV-360傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)定，波數(shù)范圍為4000～500 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描次數(shù)為6，圖譜采用Omnic Version 8.2軟件包分析，對(duì)紅外譜圖的特征吸收峰進(jìn)行峰面積計(jì)算，并對(duì)相對(duì)應(yīng)的特征基團(tuán)進(jìn)行半定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0用作試驗(yàn)后結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)，用Origin 8.6繪制圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間HAL的外觀及含量變化

通過(guò)圖1對(duì)于HAL的外觀觀察，可以發(fā)現(xiàn)秸稈中提取的HAL是深棕色的，土壤中提取的HA是黑色的，二者在顏色上有很大差異。但無(wú)論是T.reesei處理還是CK，HAL的顏色均會(huì)隨著腐殖化培養(yǎng)時(shí)間的增加而變深，而T.reesei處理在30 d的顏色比同期CK處理的顏色要更深，與土壤HA更加相近。

在30 d的腐殖化過(guò)程中2種處理的TOC呈下降趨勢(shì)，T.reesei處理差異顯著，HLM的下降是引起TOC下降的主要因素。通過(guò)表1和圖2均可以發(fā)現(xiàn)2種處理的HAL的相對(duì)含量均隨著腐殖化時(shí)間的增加而提高，T.reesei處理差異顯著。在0 d時(shí)，類腐殖質(zhì)組分中FAL有機(jī)碳含量高而HAL有機(jī)碳含量低；但在15 d時(shí)，T.reesei處理的HAL有機(jī)碳含量已超越了同期的FAL；30 d時(shí)T.reesei處理的HAL有機(jī)碳含量與CK相比增幅更大且差異顯著，其HAL的相對(duì)含量在30 d高達(dá)21.49%，是CK處理2倍左右，其PQ值在此時(shí)也是CK處理的近2倍，非常接近土壤的PQ值。但土壤HA的相對(duì)含量為28.54%，仍高于HAL的相對(duì)含量很多。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間HAL的元素組成變化

表2為不同時(shí)間下里氏木霉對(duì)HAL元素組成的影響情況。HAL在腐殖化期間呈現(xiàn)C高O低的狀態(tài)，C元素占HAL元素組成的50%以上。2種處理的HAL的C/N在培養(yǎng)一開始均在18.3左右，隨著腐殖化時(shí)間的增加均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)，T.reesei處理的下降幅度大于CK處理，并在30 d時(shí)接近土壤HA的C/N比值；2種處理的HAL在30 d內(nèi)H元素均下降，O元素均增高，T.reesei處理的變化幅度更大。

圖1 土壤HA與不同培養(yǎng)時(shí)間下HAL的外觀比較Figure 1 Comparison of the appearance between the HAL in different culture times and soil HA

表1 里氏木霉對(duì)玉米秸稈類腐殖質(zhì)組分有機(jī)碳含量的影響Table 1 Effect of T.reesei of corn straw on composition and PQ value of soil humus

圖2 里氏木霉處理下不同培養(yǎng)間的HAL相對(duì)含量Figure 2 Relative contents of HAL under T.reesei treatment in different culture time

通過(guò)對(duì)元素組成分析，可以簡(jiǎn)單分析和判斷樣品中分子結(jié)構(gòu)的變化情況。H/C可以直觀地表征HA的縮合度，O/C可以表征氧化度強(qiáng)弱，與含氧基團(tuán)數(shù)量成正比[23]。根據(jù)分析結(jié)果采用H/C和O/C原子比繪制出圖3，即范氏圖（Van Krevelen圖）。

在腐殖化培養(yǎng)開始時(shí)，無(wú)論是T.reesei還是CK處理，其堿提取物HAL都處于O/C=0.482、H/C=1.471附近的位置上；培養(yǎng)15 d以后，CK處理的位置僅有微小變化，而T.reesei處理的O/C升高，H/C下降；培養(yǎng)30 d時(shí)，CK處理的位置更加集中在O/C=0.494、H/C=1.452的附近，而T.reesei處理的位置卻更加集中在O/C=0.531、H/C=1.330的附近，在30 d內(nèi)與土壤HA的O/C差異縮減了71.08%，H/C比值差異縮減了49.25%，更加接近土壤HA的結(jié)構(gòu)特征。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間下HAL中H/C和O/C的相關(guān)性Figure 3 Correlation of H/C and O/C in HAL in different culture time

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間下里氏木霉對(duì)HAL元素組成的影響Table 2 Effect of T.reesei on the elemental composition of HAL in different culture time

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間HAL的紅外光譜

不同腐殖化培養(yǎng)時(shí)間的T.reesei、CK處理的HAL與土壤HA的FTIR如圖4所示。T.reesei與CK處理相比在官能團(tuán)區(qū)的吸收峰強(qiáng)度變化較大，而在指紋區(qū)僅略有變化，特征峰的相對(duì)影響強(qiáng)度的半定量分析見表3。

官能團(tuán)區(qū)中3400 cm-1處的寬峰是由酚類Ar-OH、羥基或羧基的O-H振動(dòng)引起。相比于CK，T.reesei處理可隨著模擬腐殖化時(shí)間的增加，增加HAL的羥基含量。2920 cm-1代表不對(duì)稱脂族-CH3的C-H伸縮振動(dòng)峰，2850 cm-1代表-CH2-對(duì)稱脂族C-H伸縮振動(dòng)峰[24]，1720 cm-1則由羧基、醛或酮的C═O振動(dòng)所致[25]，I2920/I1720的值可以衡量脂族含量[26]。2種處理的HAL在2920 cm-1的吸收峰的相對(duì)強(qiáng)度在整個(gè)培養(yǎng)期間均隨時(shí)間而增加，T.reesei的增幅大于CK；T.reesei、CK處理在1720 cm-1的吸收峰相對(duì)強(qiáng)度在0～15 d均增加，但在15～30 d時(shí)CK仍保持增加的同時(shí)T.reesei卻下降了。T.reesei處理的I2920/I1720值在0～15 d下降了0.58，而CK在此期間僅降了0.05；在15～30 d時(shí)T.reesei處理的I2920/I1720值回升，較同期仍保持下降的CK處理小0.22。1620 cm-1及1500 cm-1處來(lái)自芳香烴的C═C骨架振動(dòng)（呼吸），在確定是否有芳核的存在時(shí)有重要意義。因此I2920/I1620值可以衡量芳香性的強(qiáng)弱。T.reesei處理的HAL的I2920/I1620值在0～15 d降低了0.46，在15～30 d時(shí)下降了0.07，而同期的CK處理在30 d內(nèi)僅下降了0.06。T.reesei處理的HAL的2項(xiàng)比值在培養(yǎng)的30 d過(guò)程中更接近土壤HA，但仍與土壤HA有很大差距。

指紋區(qū)中1230 cm-1的峰歸屬于芳香基團(tuán)的COH振動(dòng)或芳基醚和酚類的C-O-C振動(dòng)，脂族的COH振動(dòng)可引起1122 cm-1處峰[27]。2種處理在上述2處的吸收峰相對(duì)強(qiáng)度在30 d內(nèi)持續(xù)增加，其中T.reesei處理的增幅更大。1034 cm-1處的峰可代表多糖與類多糖物質(zhì)中C-O的存在。T.reesei處理的HAL在1034 cm-1處的相對(duì)強(qiáng)度隨培養(yǎng)時(shí)間增加而持續(xù)降低，而CK在此處無(wú)明顯變化。

2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間HAL的熱穩(wěn)定性變化

圖5是HAL的DTA及TG曲線，HAL樣品在分解過(guò)程中表現(xiàn)為中溫放熱（326～352℃）和高溫放熱（394～535℃），且HAL始終較土壤HA多一個(gè)（394～455℃）高溫放熱峰。值得注意的是CK處理在0 d時(shí)DTA曲線與T.reesei處理相似，但其從左至右的高溫放熱峰較同期T.reesei處理的分別低24、45℃；15 d時(shí)，T.reesei處理的高溫放熱峰發(fā)生明顯變化，而CK處理的DTA曲線線型仍與0 d相似；在30 d時(shí)CK處理的高溫峰發(fā)生了分峰現(xiàn)象，而T.reesei處理在30 d時(shí)的DTA曲線線型則與土壤HA更加接近。T.reesei處理的高溫峰隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加發(fā)生了左移，并逐漸接近土壤HA放熱峰的分布位置。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間T.reesei、CK處理下的HAL與土壤HA的FTIR譜圖Figure 4 FTIR spectras of HA of soil，HAL of T.reesei and CK treatments in different culture time

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間下T.reesei、CK處理下的HAL與土壤HA的FTIR光譜主要吸收峰相對(duì)強(qiáng)度比較Table 3 Effects of relative intensity of the main absorption peaks in the FTIR spectrum of HA of soil，HAL by T.reesei and CK treatments in different culture time

表4為HAL的半定量分析，T.reesei、CK處理均隨著模擬腐殖化時(shí)間的增加，其HAL的熱量高/中、失重高/中比值在0～15 d不同程度地增加，T.reesei在30 d時(shí)的失重高/中比值有微小下降，30 d內(nèi)其2項(xiàng)比值分別提升了1.539、0.378；CK處理的2項(xiàng)比值在30 d內(nèi)僅提升了0.103、0.037。

3 討論

僅通過(guò)外觀變化便可以判定，HAL與成熟土壤中的HA仍存在著很大的差別，但伴隨著腐殖化過(guò)程中T.reesei對(duì)玉米秸稈的轉(zhuǎn)化合成與利用，使其在外觀上更加接近了HA，縮小了原本的差異。不僅是外觀的變化，HAL的相對(duì)含量在30 d時(shí)已經(jīng)是同期CK的2倍。Juradom等[28]發(fā)現(xiàn)半纖維素、纖維素和木質(zhì)素降解率比未接種微生物的堆體分別高28%、21%和25%，接種微生物可以增加HS的數(shù)量從而加快腐殖化進(jìn)程。李國(guó)平等[29]認(rèn)為放入微生物菌劑能夠較為顯著增加胡敏酸含量。

圖5 里氏木霉對(duì)HAL的DTA與TG曲線的影響Figure 5 Effects of T.reesei on DTA and TG curves of HAL

通過(guò)對(duì)不同腐殖化時(shí)間下HAL元素組成分析，發(fā)現(xiàn)接種T.reesei可以有效降低HAL的C/N值。在腐殖化的過(guò)程中C和N是最重要的2種元素，C為微生物提供能源，N可以提供微生物建造細(xì)胞結(jié)構(gòu)[30]。Eneji等[31]通過(guò)元素分析得出秸稈堆肥過(guò)程中類胡敏酸的結(jié)構(gòu)是C高O低的，表明其氧化程度較低，同時(shí)堆肥過(guò)程中有機(jī)物含量、總C含量一般呈減少的趨勢(shì)，但腐殖酸的相對(duì)含量是增加的。Amir等[32]通過(guò)元素分析得出，在好氧發(fā)酵過(guò)程中HA的H含量減少，H/C值和C/N值下降。而在本實(shí)驗(yàn)中，C元素在HAL中表現(xiàn)為先下降后升高的變化趨勢(shì)。這可以歸因于在15～30 d的高分解階段，釋放出了一些來(lái)自其他頑固結(jié)構(gòu)（如木質(zhì)素）中的一些脂族化合物。Sánchez-Monedero等[33]曾研究表明，在堆肥過(guò)程中一些其他物質(zhì)如木質(zhì)素的降解殘留物被釋放出來(lái)，其表現(xiàn)的特征與HA類似，并會(huì)在pH=2時(shí)沉淀。

通過(guò)分析范氏圖的分布狀況，結(jié)合FTIR譜圖，可以得出接種T.reesei處理的HAL的O/C呈現(xiàn)出均值增加又略有下降的趨勢(shì)，可以歸因于在15～30 d新被釋放出的氧化度較低的脂族化合物致使O/C值下降，這與HAL在30 d時(shí)的I2920/I1720值和中溫放熱回升、失重下降變緩的結(jié)果相符。T.reesei處理下的HAL的H/C卻能持續(xù)降低，且在FTIR和DTA、TG的分析結(jié)果中顯示前0～15 d時(shí)HAL的芳香性增加速度高于15～30 d。促成這種現(xiàn)象的原因是0～15 d的腐殖化過(guò)程中，HAL中的脂族碳易被利用，而芳香碳較穩(wěn)定在此期間被保留，即核心胡敏酸（cHAL）在此期間逐漸暴露，致使H/C下降，這一結(jié)果符合多酚學(xué)說(shuō)。Adani等[34]將HAL分為不易被生物利用的的穩(wěn)定組分（芳香碳）和易被微生物降解的不穩(wěn)定組分（脂肪族碳）研究，他提出HAL的形成是通過(guò)不穩(wěn)定部分的降解和更穩(wěn)定部分的保存而進(jìn)行。但HAL的降解與合成是同時(shí)進(jìn)行的，很顯然在15～30 d時(shí)，伴隨著降解過(guò)程中脂族性物質(zhì)的不斷釋放增多，芳香族/脂肪族的比例仍在顯著提升，這要?dú)w功于T.reesei的合成作用。Jouraiphy等[35]通過(guò)傅里葉紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)HS在好氧發(fā)酵后芳香結(jié)構(gòu)增多，其來(lái)源于發(fā)酵原料和微生物合成。Awasthi等[36]研究表明，接種真菌處理的HAL芳香化程度比未接種處理更高。在本研究的FTIR的半定量分析中，T.reesei處理下的HAL在1620 cm-1處和1500 cm-1處來(lái)自芳香烴的C═C骨架振動(dòng)的吸收峰強(qiáng)度持續(xù)增加、I2920/I1620比值持續(xù)降低也均可證明HAL的結(jié)構(gòu)在模擬腐殖化的過(guò)程中芳香性持續(xù)增加。在HAL和HLS的DTA與TG分析中也可以發(fā)現(xiàn)接種T.reesei可以在30 d內(nèi)大幅改變芳香性與脂族性物質(zhì)的比例分布，增加熱穩(wěn)定性。

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間下里氏木霉HAL及土壤HA的放熱與失重比較分析Table 4 Exothermic heat and mass loss of T.reesei's HAL in different culture times and soil HA

通過(guò)觀察FTIR譜圖中1034 cm-1處的相對(duì)強(qiáng)度變化，可以判斷在T.reesei處理下的HAL中，多糖類物質(zhì)在30 d內(nèi)大幅下降，相對(duì)于HAL中的其他碳源，多糖更容易被T.reesei消耗和利用，González-Pérez等[37]認(rèn)為多糖在HA中的含量可以表征該土壤有機(jī)質(zhì)組成與植物殘?bào)w的接近程度。HA中的多糖類物質(zhì)含量越低，其腐殖質(zhì)越成熟，1034 cm-1處影響強(qiáng)度的降低預(yù)示著T.reesei可以在30 d內(nèi)有效促進(jìn)HAL向成熟的HA轉(zhuǎn)化。

4 結(jié)論

（1）在30 d的腐殖化過(guò)程中，接種里氏木霉（T.reesei）可以顯著改變其培養(yǎng)產(chǎn)物的堿提取物——類胡敏酸（HAL）的結(jié)構(gòu)特征，其芳香性/脂族性的比例變化支持了多酚學(xué)說(shuō)。

（2）HAL在整個(gè)過(guò)程中隨著模擬腐殖化時(shí)間的增加，與土壤HA的特征差異持續(xù)縮小。里氏木霉可以在30 d內(nèi)將HAL的元素結(jié)構(gòu)集中在O/C=0.528、H/C=1.322左右，與土壤HA的O/C比值、H/C比值差異縮減了71.08%、49.25%。

（3）里氏木霉在降低HAL的脂族性、增強(qiáng)芳構(gòu)化程度和熱穩(wěn)定性方面能力很強(qiáng)，可以高效促進(jìn)玉米秸稈的腐殖化進(jìn)程。雖然里氏木霉處理下的HAL并不具備與土壤HA完全相同的特異性，但其可隨著模擬腐殖化時(shí)間的增加，與土壤HA的結(jié)構(gòu)特征差異持續(xù)縮小，逐漸具有特異性。為利用里氏木霉與玉米秸稈腐殖化的應(yīng)用提供參考。