張 莉，沈文靜，方志翔，劉 標(biāo)

（生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,南京 210042）

玉米害蟲和田間雜草是影響玉米產(chǎn)量的重要因素，因此，增強(qiáng)玉米對(duì)害蟲和雜草的抵抗力一直是玉米品種改良的重要內(nèi)容[1]，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗蟲基因和耐除草劑基因同時(shí)轉(zhuǎn)入玉米基因組中，培育出抗蟲/耐除草劑雙抗轉(zhuǎn)基因玉米新品種，這一技術(shù)的成功應(yīng)用不僅顯著降低蟲害和草害對(duì)玉米產(chǎn)量的影響，增加農(nóng)民收入，而且還避免了大量使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染、害蟲產(chǎn)生抗藥性等各種弊端，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義。

與傳統(tǒng)育種技術(shù)不同，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在創(chuàng)造優(yōu)良種質(zhì)資源和培育植物新品種的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境和人類健康可能存在的風(fēng)險(xiǎn)也不能忽視[2]。轉(zhuǎn)基因作物培育過程中，外源基因的隨機(jī)插入，可能會(huì)影響轉(zhuǎn)基因作物本身內(nèi)源基因的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)，如改變作物中的營(yíng)養(yǎng)元素、抗?fàn)I養(yǎng)因子或固有植物毒素的表達(dá)水平等[3-5]，如果轉(zhuǎn)基因作物發(fā)生了這些改變，可能會(huì)對(duì)一些生物的健康產(chǎn)生潛在影響。現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要為大型禽畜[6-8]、小型嚙齒動(dòng)物[9-11]，對(duì)水生生物的研究以某些魚類為主[12-15]，而對(duì)于可直接或間接接觸到轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的小型水生動(dòng)物的研究主要集中于毛翅目石蛾幼蟲[16-18]以及雙翅目蚊子幼蟲[18]。

轉(zhuǎn)基因作物種植區(qū)及周邊溝渠、池塘等自然水域，是許多無脊椎浮游動(dòng)物的棲息地，轉(zhuǎn)基因作物在栽培和生長(zhǎng)過程中，其碎屑物、花粉等可能會(huì)借助風(fēng)力、水流、動(dòng)物攜帶等方式進(jìn)入周邊水體，從而使周邊水體中的水生生物接觸到轉(zhuǎn)基因成分。由于轉(zhuǎn)基因作物及相關(guān)成分進(jìn)入水體是一種有機(jī)物質(zhì)的輸入，可能會(huì)對(duì)無脊椎動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)、數(shù)量以及攝食行為等產(chǎn)生影響[19]，因此評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)環(huán)境中某些代表性水生無脊椎物種的潛在毒性效應(yīng)，對(duì)農(nóng)田及周邊水生生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性保護(hù)具有重要意義。大型蚤（Daphnia magna）為浮游動(dòng)物的重要類群，是水中細(xì)菌、單細(xì)胞藻類、有機(jī)物碎屑的主要消費(fèi)者，也是魚類等水生生物的天然餌料。由于大型蚤對(duì)5～50 μm粒徑的食物沒有自主選擇性[20-22]，其在濾食過程中，可能會(huì)取食到含有轉(zhuǎn)基因成分的碎屑物[22]；另外，大型蚤作為水生模式動(dòng)物，生活周期短、室內(nèi)培養(yǎng)簡(jiǎn)易、對(duì)污染物反應(yīng)靈敏[23-24]，已具備成熟的環(huán)境物質(zhì)監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)方法，因此本研究以大型蚤為研究對(duì)象，運(yùn)用亞慢性毒理學(xué)原理，在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030對(duì)水生代表性物種的影響，以期為轉(zhuǎn)基因玉米的生態(tài)環(huán)境安全提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所使用的抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030（ZZM030）為中國(guó)種子集團(tuán)有限公司自主研發(fā)品系，是以親本對(duì)照玉米祥249（X249）為受體材料，插入外源cry1Ab/c基因以及epsps基因，同時(shí)具有抗蟲特性和對(duì)草甘膦和草丁膦除草劑的抗性。

將ZZM030籽粒和X249籽粒剔除霉變粒、秸稈等雜物后，使用TGQ20流化床超音速氣流粉碎分級(jí)機(jī)低溫（＜10℃）粉碎至粒徑＜10 μm，粉碎后的玉米粉-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，使用時(shí)用大型蚤水生四號(hào)培養(yǎng)液[25]配制成1.5 g·L-1的米粉液。為避免樣品間的交叉污染，首先對(duì)親本玉米進(jìn)行籽粒粉碎。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物大型蚤（Daphnia magna）為本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)3代以上、具有相同遺傳背景的孤雌生殖幼蚤，蚤齡小于24 h。試驗(yàn)蚤在測(cè)試前，依據(jù)大型蚤毒性試驗(yàn)敏感性要求，測(cè)定20℃時(shí)重鉻酸鉀（Sigma，美國(guó)）24 h半數(shù)效應(yīng)濃度（24 h-EC50）。測(cè)定結(jié)果顯示，重鉻酸鉀24 h-EC50為1.127 mg·L-1，符合實(shí)驗(yàn)要求[26]。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)分小球藻（Chlorella vulgaris）組、X249玉米粉組和ZZM030玉米粉組3個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只大型蚤。實(shí)驗(yàn)容器為50 mL燒杯，并盛放40 mL大型蚤培養(yǎng)液[25]，每個(gè)燒杯隨機(jī)放置1只蚤。試驗(yàn)過程中，各處理組大型蚤每日飼喂1次，其中小球藻組飼喂?jié)饪s后的小球藻藻液，密度約為5×105個(gè)·mL-1，X249玉米粉組和ZZM030玉米粉組分別飼喂?jié)舛葹?.5 g·L-1的玉米粉1 mL，本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參照了文獻(xiàn)[22，27]的方法。實(shí)驗(yàn)過程中，每日定時(shí)觀察和記錄各處理組大型蚤存活和繁殖情況，大型蚤開始繁殖后，記錄各處理組蚤繁殖情況，并將新生幼蚤移出。實(shí)驗(yàn)過程中，每隔2 d更新1次培養(yǎng)液。試驗(yàn)初始、第7、14、21 d和第28 d時(shí)，使用顯微鏡（LEICAM125）測(cè)定大型蚤體長(zhǎng)。試驗(yàn)在培養(yǎng)箱（Binder-KBF720，德國(guó)）中進(jìn)行，溫度（22±1）℃，光暗比16 h∶8 h，光強(qiáng)60 μmol·m-2s-1，共持續(xù)28 d。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和整理，用IBM SPSS 17.0軟件ANOVA程序中的單因素方差分析及Tukey′s test多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性差異分析，以P=0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)上檢驗(yàn)的顯著性水準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 存活率

圖1顯示的是飼喂小球藻、親本玉米X249和抗蟲耐除草劑玉米ZZM030的實(shí)驗(yàn)蚤28 d存活率變化情況。如圖1所示，小球藻組大型蚤在測(cè)試期內(nèi)存活率緩慢下降，雖然個(gè)別試驗(yàn)蚤在幼齡期及成齡早期（＜7 d）存在死亡現(xiàn)象，但7 d后實(shí)驗(yàn)蚤存活率緩慢下降，至28 d試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小球藻組存活率達(dá)46%。與對(duì)照小球藻組相比，飼喂X249和ZZM030玉米粉均使大型蚤死亡率增加，在試驗(yàn)期內(nèi)，兩個(gè)玉米粉組試驗(yàn)蚤隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加均有一定的死亡，方差分析顯示ZZM030組大型蚤和親本X249組大型蚤存活率沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同處理組大型蚤存活率變化Figure 1 Survival rate of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris，X249 maize and ZZM030 transgenic maize

2.2 體長(zhǎng)

研究測(cè)定了不同食物飼喂條件下試驗(yàn)蚤初始、第7、14、21 d及第28 d體長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，不同食物飼喂條件下大型蚤的體長(zhǎng)不同（圖2）。小球藻組試驗(yàn)蚤體長(zhǎng)在試驗(yàn)初期增長(zhǎng)較快，14 d后，體長(zhǎng)緩慢增長(zhǎng)。而兩個(gè)玉米粉組試驗(yàn)蚤體長(zhǎng)試驗(yàn)期內(nèi)呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，從試驗(yàn)初始至第28 d，飼喂抗蟲耐除草劑玉米ZZM030的大型蚤體長(zhǎng)與親本X249組試驗(yàn)蚤體長(zhǎng)相當(dāng)，兩者之間沒有顯著差異。至28 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小球藻組、X249組和ZZM030組大型蚤平均體長(zhǎng)分別為（3.82±0.25）mm、（2.54±0.14）mm和（2.64±0.22）mm，兩個(gè)玉米粉組實(shí)驗(yàn)蚤最終體長(zhǎng)與小球藻組實(shí)驗(yàn)蚤最終體長(zhǎng)達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），但X249和ZZM030玉米粉組大型蚤間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 繁殖

不同飼喂處理?xiàng)l件下大型蚤的繁殖參數(shù)見表1。飼喂親本玉米X249和抗蟲耐除草劑玉米ZZM030的大型蚤在首次抱卵時(shí)間、首次產(chǎn)幼蚤時(shí)間、新生幼蚤總數(shù)上與小球藻組實(shí)驗(yàn)蚤均有顯著差異（P＜0.05）。對(duì)于X249組和ZZM030組大型蚤，統(tǒng)計(jì)分析表明，抗蟲耐除草劑玉米ZZM030和親本玉米X249組大型蚤在上述參數(shù)上均無顯著性差異（P＞0.05），28 d試驗(yàn)期內(nèi)，各處理組試驗(yàn)蚤均未出現(xiàn)卵鞍。

3 討論

地上水域和鄰近陸地環(huán)境密切相關(guān)[28]，轉(zhuǎn)基因作物在生長(zhǎng)過程中，風(fēng)力可使作物花粉漂移到110 m遠(yuǎn)的地方[29]，雨水也可以使花粉脫落并隨水流轉(zhuǎn)運(yùn)，作物收獲后，滯留在農(nóng)田內(nèi)的作物殘?bào)w可被風(fēng)或水流運(yùn)送到周圍水體，這些轉(zhuǎn)基因作物副產(chǎn)品一旦進(jìn)入水域，可能會(huì)被微生物分解、水生動(dòng)物消耗、沉積或漂流至下游水域，并成為農(nóng)業(yè)灌溉水渠中碎屑物的組分之一[16]。轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)和應(yīng)用過程中，含有外源蛋白的作物碎屑物進(jìn)入水體后，是否會(huì)對(duì)食碎屑類生物產(chǎn)生不利影響？基于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)水生生物可能存有生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)，本研究以抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030及其親本非轉(zhuǎn)基因玉米祥249為研究材料，以水生生物大型蚤為研究對(duì)象，使大型蚤的食物來源全部為轉(zhuǎn)基因玉米碎屑物，室內(nèi)可控條件下研究轉(zhuǎn)基因作物材料對(duì)特定非靶標(biāo)水生生物的影響。

圖2 不同處理組大型蚤的體長(zhǎng)變化Figure 2 Body size of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris，X249 maize and ZZM030 transgenic maize

表1 不同處理組大型蚤繁殖參數(shù)Table 1 Fecundity of Daphnia magna fed with Chlorella vulgaris，X249 maize and ZZM030 transgenic maize

在28 d測(cè)試期內(nèi)，以抗蟲耐除草劑玉米ZZM030飼喂大型蚤，通過大型蚤存活率、體長(zhǎng)、首次抱卵時(shí)間、首次產(chǎn)幼蚤時(shí)間和新生幼蚤總數(shù)等參數(shù)，評(píng)價(jià)ZZM030對(duì)大型蚤的安全性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與飼喂X249親本玉米粉的大型蚤相比，ZZM030玉米粉組大型蚤的生長(zhǎng)指標(biāo)存活率和體長(zhǎng)，以及首次抱卵時(shí)間等繁殖指標(biāo)（表1）與親本玉米沒有顯著差異，實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)有性生殖的卵鞍，這些結(jié)果說明ZZM030轉(zhuǎn)基因玉米并沒有對(duì)大型蚤產(chǎn)生不良影響。Mendelson等[30]使用 100 mg·L-1和 150 mg·L-1的轉(zhuǎn)cry1Ab花粉和100 mg·L-1轉(zhuǎn)cry1F基因玉米花粉飼喂大型蚤48 h，測(cè)試期間大型蚤沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)。張莉等[27]使用轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5飼喂大型蚤28 d也得到了相似的結(jié)論。與我們的研究結(jié)果不同的是，B?hn 等[22，31]使用轉(zhuǎn) cry1Ab基因玉米飼喂大型蚤 42 d，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比Bt玉米組的大型蚤適合度下降，使用轉(zhuǎn)基因玉米飼喂的大型蚤死亡率增加、實(shí)驗(yàn)蚤性成熟時(shí)間延長(zhǎng)、新生幼蚤總數(shù)下降，其他一些轉(zhuǎn)基因作物對(duì)大型蚤的室內(nèi)評(píng)價(jià)研究也有相似結(jié)論[32-33]?，F(xiàn)有以大型蚤為試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)研究，通常采用不同的評(píng)價(jià)時(shí)間、不同的劑量水平和評(píng)價(jià)參數(shù)來達(dá)到評(píng)價(jià)目的，而轉(zhuǎn)基因作物的品種、飼喂劑量、暴露時(shí)間等參數(shù)的不同[34]，都可能會(huì)對(duì)大型蚤受試物毒性評(píng)價(jià)的結(jié)果產(chǎn)生影響，上述結(jié)果的不一致性可能與下列因素有關(guān)：（1）轉(zhuǎn)基因作物品種差異。上述研究者使用的轉(zhuǎn)基因玉米材料在目標(biāo)基因上明顯不同，受體材料和轉(zhuǎn)育過程也不盡相同，這些遺傳背景上的差異可能產(chǎn)生的非預(yù)期效應(yīng)的類型和程度，以及不同材料組成成分上的差異都會(huì)在一定程度上影響大型蚤評(píng)價(jià)結(jié)果；（2）暴露時(shí)間不同。大型蚤在受試物中的暴露時(shí)間不同，對(duì)大型蚤產(chǎn)生的影響也會(huì)不同[25]。研究者用大型蚤進(jìn)行飼喂試驗(yàn)時(shí)，暴露時(shí)間在48 h～42 d不等，本研究采用28 d，0～28 d這一時(shí)間段涵蓋了大型蚤幼齡期及成齡期，此時(shí)大型蚤生長(zhǎng)和繁殖已經(jīng)趨于穩(wěn)定[35]，能夠得出穩(wěn)定可靠的評(píng)價(jià)結(jié)果。而B?hn等[22，31]選用42 d，暴露時(shí)間的延長(zhǎng)雖然可能將一些不良效應(yīng)或微小變化所產(chǎn)生的影響表現(xiàn)出來，但此時(shí)大型蚤已趨于衰老，衰老過程中抗氧化防御體系的損壞以及抗逆性變化等不可控因素可能會(huì)干擾評(píng)價(jià)結(jié)果[36-37]。

目前轉(zhuǎn)基因作物對(duì)大型蚤生態(tài)安全性評(píng)價(jià)研究中，研究者多參照經(jīng)典毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法，與化學(xué)品組分明確和結(jié)構(gòu)明晰不同，轉(zhuǎn)基因作物在營(yíng)養(yǎng)成分、潛在致敏性、代謝產(chǎn)物等方面可能存在一些不確定因素，這在一定程度上突出了轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)的復(fù)雜性，因此評(píng)價(jià)過程中，盡可能使實(shí)驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化、選擇合理的響應(yīng)參數(shù)，這將有助于得到可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和評(píng)價(jià)結(jié)果。在使用轉(zhuǎn)基因作物對(duì)大型蚤進(jìn)行生態(tài)安全性評(píng)價(jià)研究中，研究者多以作物種子或果實(shí)、花粉、葉片等作為測(cè)試材料，這些材料以微粒形式進(jìn)入大型蚤培養(yǎng)液時(shí)，若飼喂劑量較低，則不能滿足大型蚤的生存需求；若飼喂劑量過高，富余的受試材料微粒懸浮在培養(yǎng)液中，這部分受試物微粒容易黏附于大型蚤的觸角、殼刺等部位，使大型蚤浮游能力下降，還易引起培養(yǎng)液水質(zhì)惡化，進(jìn)而間接增加培養(yǎng)液的更新頻率，由此也可能增加大型蚤機(jī)械性損傷。因此，使用不同轉(zhuǎn)基因作物材料進(jìn)行研究時(shí)，盡可能選擇合理的受試材料濃度，并加強(qiáng)培養(yǎng)液水體環(huán)境變化檢測(cè)，這將有助于降低環(huán)境條件引起的可能誤差。另外，本研究在評(píng)估轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030對(duì)大型蚤生長(zhǎng)和繁殖的影響評(píng)價(jià)時(shí)，優(yōu)先選擇大型蚤存活率、體長(zhǎng)、新生幼蚤總數(shù)3個(gè)最常用的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，而其他一些可以量化的指標(biāo)，如受試蚤首次繁殖時(shí)間、首次新生幼蚤數(shù)、產(chǎn)幼蚤次數(shù)、試驗(yàn)期間是否有卵鞍出現(xiàn)等指標(biāo)能夠提供一些亞毒性效應(yīng)信息，這些參數(shù)作為輔助檢測(cè)指標(biāo)能夠更好地說明轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030是否對(duì)大型蚤產(chǎn)生某些不利影響。

4 結(jié)論

本研究以抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米ZZM030（ZZM030）及其親本非轉(zhuǎn)基因玉米祥249（X249）為研究材料，以ZZM030和X249玉米粉為食物來源對(duì)大型蚤進(jìn)行28 d飼喂實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米材料ZZM030對(duì)大型蚤生長(zhǎng)和繁殖產(chǎn)生不良影響，28 d飼喂結(jié)果表明抗蟲耐除草劑玉米ZZM030與X249親本玉米對(duì)大型蚤具有同樣的安全性。