劉本帥，鄭圣晗，原小雅，陳 穎，張 莘，王統(tǒng)苗，陳博雯，張 揚(yáng)，王志秀，常國(guó)斌，陳國(guó)宏

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

【研究意義】主要組織相容性復(fù)合體(MHC，major histocompatibility complex)分子是一種受體多基因家族，其功能是結(jié)合并提呈抗原肽給T細(xì)胞。許多不同種類(lèi)的MHC基因都具有同源性，它們來(lái)自于同一個(gè)原始基因區(qū)，在進(jìn)化過(guò)程中，隨著環(huán)境和條件的變化，基因具有不同的分化方式，這樣同一MHC基因區(qū)可形成不同的基因產(chǎn)物，從而使MHC有許多種不同的等位基因[1]。MHC II 類(lèi)分子就是其中之一，其主要分布于抗原遞呈細(xì)胞(Antigen-presenting cell, APC)表面, 遞呈經(jīng)過(guò)處理的外源性抗原肽供CD4+ T細(xì)胞識(shí)別, 通過(guò)輔助性T細(xì)胞, 激活抗體免疫應(yīng)答[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在小鼠中免疫增強(qiáng)衣原體特異性免疫應(yīng)答而開(kāi)發(fā)了沙眼衣原體納米抗體(PPM)的報(bào)到中提到CD4 +細(xì)胞都可以在小鼠中提供抗衣原體免疫[3]。DMB2基因是雞MHC基因家族II類(lèi)一個(gè)典型基因座，其基因編碼產(chǎn)物是抗原分子，對(duì)雞的免疫調(diào)控起著重要作用。一般情況下MHC基因在動(dòng)物物種內(nèi)呈高度多態(tài)性。由核苷酸發(fā)生替換而形成的多態(tài)性有利于MHC分子與多種抗原肽的結(jié)合[4]。MHCII類(lèi)分子是由α(DMA)和β(DMB)鏈組成的異二聚體，它位于細(xì)胞內(nèi)囊泡[5]。MHC II類(lèi)分子表達(dá)的增加可能會(huì)改變胸腺發(fā)育過(guò)程中的T細(xì)胞受體庫(kù)，并影響成熟T細(xì)胞的存活和擴(kuò)增。許多證據(jù)證實(shí)，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的水平參與調(diào)節(jié)MHC II類(lèi)基因的表達(dá)，并且都促成了自身免疫性疾病的傾向[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】DM通過(guò)幫助從肽結(jié)合位點(diǎn)釋放CLIP(II類(lèi)相關(guān)恒定鏈肽)分子而在MHC II類(lèi)分子的肽加載中起核心作用?？梢?jiàn)DMB2基因在雞的免疫反應(yīng)中起著不可或缺的作用。但是不同雞DMB2基因序列特征及其表達(dá)特性的研究較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以25個(gè)常見(jiàn)雞種為研究素材，利用目標(biāo)序列捕獲方法對(duì)DMB2基因進(jìn)行SNPs、Indels分析，為探明該基因的遺傳特性以及家禽的抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雞品種來(lái)源及DNA提取方法

本研究共選取25個(gè)雞品種：其中白耳雞(BE)、茶花雞(CH)、大骨雞(DG)、斗雞(DJ)、固始雞(GS)、狼山雞(HL)、鹿苑雞(LU)、泰和烏骨雞(WG)、仙居雞(XJ)、蕭山雞(XS)、北京油雞(YJ)、藏雞(ZJ)等12個(gè)地方雞種來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院家禽科學(xué)研究所，紅色原雞(HY)采自云南省野生動(dòng)物救護(hù)中心，安卡雞(AK)、廣西黃雞(GX)、 SPF-來(lái)航雞(SPF-LH)、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(LK)、羅斯雞(LS)、溧陽(yáng)雞(LY)、青腳麻雞(QJ)、如皋黃雞(RG)、太湖雞(TH)、文昌雞(WC)、雪山雞(XC)、隱性白羽雞(YB)等12個(gè)雞種來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室禽種資源基因庫(kù)。每個(gè)雞種隨機(jī)選取10羽雞，翅下靜脈采血2 mL，然后放入具有肝素鈉的采血管中，加入裂解液，用苯酚和氯仿抽提法提取DNA，4 ℃冷藏保存。

1.2 DMB2基因序列對(duì)比分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

將DNA樣品送深圳華大基因公司進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測(cè)序。利用MEGA6軟件對(duì)25個(gè)雞種進(jìn)行核苷酸序列對(duì)比分析，統(tǒng)計(jì)核苷酸突變位點(diǎn)和插入缺失位點(diǎn)以及氨基酸變化位點(diǎn)，最后利用MEGA6軟件運(yùn)用鄰接法(Neighbour Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(Phylogenetic tree)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雞種中DMB2基因SNPs位點(diǎn)及Indels位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

使用MEGA6軟件比對(duì)26段不同雞品種的DMB2基因序列(包括參考序列)后發(fā)現(xiàn)，如表1所示，DMB2基因在25個(gè)雞種中共有281個(gè)SNPs和Indels位點(diǎn)，但是主要位于內(nèi)含子上。其中1、4外顯子和5內(nèi)含子沒(méi)有SNPs位點(diǎn)，其余外顯子上有較少的SNPs和Indels位點(diǎn)?？梢?jiàn)DMB2基因有較高的保守性。

2.2 DMB2基因外顯子SNPs位點(diǎn)分布

由表2可知，25個(gè)雞種中，斗雞、仙居雞、蕭山雞、太湖雞等十種沒(méi)有SNPs位點(diǎn)，各品種總體上SNPs位點(diǎn)都較少且比較集中，而只有SPF-來(lái)航雞的SNPs位點(diǎn)相對(duì)較多，表明各DMB2基因是序列比較保守的一類(lèi)。而部分突變位點(diǎn)未導(dǎo)致了氨基酸變化，這表明DMB2基因在各種雞中的表達(dá)效果相似。說(shuō)明DMB2基因在不同雞品種中起著相同的免疫特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)各種雞的 SNP 位點(diǎn)均較少，說(shuō)明各DMB2基因是序列的保守性很高。這也間接說(shuō)明這類(lèi)基因在免疫防御方面具有重要的作用。

表1 不同雞種中DMB2基因外顯子和內(nèi)含子SNP和Indels分布情況

表2 DMB2基因在不同雞種中突變分布和氨基酸的變化

經(jīng)比對(duì)，25個(gè)不同雞種中Indels位點(diǎn)均存在于內(nèi)含子上，由表3可見(jiàn)，共有22個(gè)雞種在內(nèi)含子4上發(fā)生基因插入，只有固始雞、綠殼蛋雞、隱性白羽雞未發(fā)生突變。比較特別的是只有在泰和烏骨雞內(nèi)含子2上有一段較長(zhǎng)的缺失。雖然這些插入和缺失都發(fā)生在內(nèi)含子上，但是這可能會(huì)導(dǎo)致DMB2基因翻譯產(chǎn)物發(fā)生改變。

表3 不同雞種DMB2基因InDels分布

注：D和I分別表堿基缺失和插入，后面帶的數(shù)字表示堿基數(shù)，即I1表示有1個(gè)堿基插入。

Note: D and I base loss and insertion, respectively, followed by a number that base number, that is, I1 said a base insert.

圖1 不同雞品種DMB2基因NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Different chicken breeds DMB2 gene NJ phylogenetic tree

2.3 DMB2基因進(jìn)化樹(shù)分析

不同雞種DMB2基因表現(xiàn)出一定的保守性，為了進(jìn)一步探究不同雞種DMB2基因同源性，我們對(duì)26個(gè)雞種用MEGA6軟件構(gòu)建NJ(Neighbour-Joining)進(jìn)化樹(shù)，探究其同源性。如圖2所示，樹(shù)枝的長(zhǎng)度代表了樹(shù)的距離，樹(shù)枝上顯示Bootstrap 1000個(gè)循環(huán)設(shè)置的置信度。由圖知26個(gè)雞種分為5大類(lèi)，我國(guó)南方優(yōu)良地方品種太湖雞、茶花雞、狼山雞、紅色原雞來(lái)自同一條分支；國(guó)外品種羅斯雞、隱性白羽雞與固始雞、鹿苑雞、仙居雞來(lái)自同一條分支；抗病性較強(qiáng)的廣西黃雞、SPF-來(lái)航雞、藏雞、雪山草雞來(lái)自同一條分支。上述結(jié)果表明，不同類(lèi)型的地方雞種同源性較小，我國(guó)不同地方雞種DMB2基因在進(jìn)化過(guò)程形成了其特有的免疫特點(diǎn)。

3 討 論

MHC基因是脊椎動(dòng)物多態(tài)性最高的基因。而作為其典型基因座DMB2基因卻呈現(xiàn)出一定的保守性。在哺乳動(dòng)物中，DM分子在其表達(dá)于細(xì)胞表面之前參與經(jīng)典II類(lèi)肽復(fù)合物的形成。已經(jīng)顯示，沒(méi)有DM這些復(fù)合物是不穩(wěn)定的，破壞抗原呈遞。位于小鼠MHC的Pb和Ob基因之間的3個(gè)新基因(DMA，DMB1和DMB2)具有表明它們是MHC II類(lèi)基因家族的成員的性質(zhì)，但是它們是迄今為止鑒定的最不相同的II類(lèi)成員[7]。幾乎所有關(guān)于哺乳動(dòng)物外MHC II類(lèi)分子的結(jié)構(gòu)和功能的知識(shí)都來(lái)自對(duì)雞的研究。大部分與II類(lèi)系統(tǒng)有關(guān)的基因存在于雞中，因此抗原加工和肽加載機(jī)制可能與哺乳動(dòng)物相似[8]。因此對(duì)雞的MHC II類(lèi)基因的研究顯得尤為重要。與導(dǎo)致MHC I類(lèi)分子的肽裝載的相對(duì)充分表征的途徑相比，關(guān)于MHC II類(lèi)的抗原加工和呈遞知之甚少。II類(lèi)獲得肽的位置是有爭(zhēng)議的，并且還不清楚在抗原遞呈細(xì)胞中II類(lèi)肽結(jié)合所需要的成分[9]。

雞中存在3種DM基因：DMA，DMB1和DMB2。它們與哺乳動(dòng)物DM基因同源并在各種免疫相關(guān)組織中表達(dá)。DM在雞中的存在證明它們存在于原始MHC中的假設(shè)是成立的。DMA,DMB1和DMB2的mRNA存在于脾組織中，DMA的mRNA也可以從腦和法氏囊組織中擴(kuò)增，DMB2的mRNA從腦，法氏囊和肺組織中擴(kuò)增，沒(méi)有從心臟組織獲得擴(kuò)增[10]。這說(shuō)明DM基因主要在免疫器官表達(dá)。與導(dǎo)致MHC I類(lèi)分子的肽裝載的相對(duì)充分表征的途徑相比，關(guān)于MHC II類(lèi)的抗原加工和呈遞知之甚少。II類(lèi)獲得肽的位置是有爭(zhēng)議的，并且還不清楚在抗原遞呈細(xì)胞中II類(lèi)肽結(jié)合所需要的成分。盡管小鼠的兩個(gè)DMB基因非常相似，然而鵪鶉和火雞兩個(gè)種類(lèi)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中的DM序列，兩個(gè)DMB基因似乎不太相似。Carrington等研究表明盡管在雞中B-DM基因中多態(tài)性頻繁，但是它們并不像在哺乳動(dòng)物中所報(bào)道的經(jīng)典的II類(lèi)基因那樣多[11]。 Atkinson等人的初步分析在保留DM分子推定的側(cè)面的結(jié)論中得出結(jié)論，暗示如果這些位點(diǎn)是保守的，那么來(lái)自任何單倍型的經(jīng)典II類(lèi)分子將結(jié)合任何其他單元型的DM分子。這個(gè)假設(shè)與我們的結(jié)果是一致的，顯示了DM分子的多態(tài)性總體低水平和特定結(jié)構(gòu)域的保守性[12]。

本研究結(jié)果表明，DMB2基因序列上snps和Indels比較少，主要分布在Exon2上。Exon3、Exon6上也有少量snps和Indels，但是氨基酸表達(dá)上未發(fā)生變化。說(shuō)明了DMB2基因有很高的保守性，這在MHC家族中是并不多見(jiàn)的，從側(cè)面說(shuō)明了DMB2基因是各種雞必不可很少的。其中SPF-LH雞在25種雞中SNP是最多的，這可能與它們是國(guó)外雞種，且生長(zhǎng)速度快、性成熟早有關(guān)。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，太湖雞、茶花雞、狼山雞、紅色原雞來(lái)自同一條分支，這些地方雞種同樣有著耐粗飼，抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)；國(guó)外品種羅斯雞、隱性白羽雞與固始雞、鹿苑雞、仙居雞來(lái)自同一條分支，其共同特點(diǎn)是產(chǎn)蛋性能都比較好；廣西黃雞、SPF-來(lái)航雞、藏雞、雪山草雞來(lái)自同一條分支，它們的雛雞都有著抗病性強(qiáng)的特點(diǎn)。

4 結(jié) 論

我國(guó)各雞種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，各雞種之間同源性較低。但是與大部分MHC家族基因不同的是各種雞DMB2基因外顯子上突變都比較少，該基因有著很高的保守性，說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中DMB2基因是不可或缺的，DMB2基因在雞免疫反應(yīng)過(guò)程在起著重要作用。