張亞楠，王 永,，朱江江，許 晴，林亞秋*

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2. 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部、四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

【前人研究進展】水通道蛋白7(aquaporin 7，AQP7)是1997年Ishibashi K等[1]在大鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)的具有促進甘油穿過細胞膜轉(zhuǎn)運能力的成孔跨膜蛋白，屬于水通道蛋白(AQPs)家族中的重要成員。目前為止，研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白家族成員共有13個，即AQP0-APQ12，按功能可分為只轉(zhuǎn)運水分子的AQPs、既可轉(zhuǎn)運水分子又可轉(zhuǎn)運甘油的水甘油通道和其功能尚未闡明的超AQPs三個亞家族[2]，而AQP7是一類水甘油通道蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，AQP7能控制脂肪細胞中脂肪源甘油的轉(zhuǎn)運，其缺乏可降低質(zhì)膜甘油通透性，減少血漿甘油，同時可提高脂肪細胞甘油激酶活性和促進甘油三酯的合成，進而導(dǎo)致脂肪細胞內(nèi)甘油和甘油三酯的蓄積，從而增加脂肪細胞體積和脂肪組織質(zhì)量[3-7]。同時體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn)AQP7在體內(nèi)控制胰島β細胞數(shù)量和胰島素分泌方面起著關(guān)鍵作用[8]。胰島素刺激體外人網(wǎng)膜脂肪組織可增加AQP7蛋白表達，但是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑可抑制這種現(xiàn)象[9]。與之相反，異丙腎上腺素是一種選擇性的β-激動劑，它能刺激脂肪分解，降低AQP7的豐度[10]?！狙芯恳饬x】藏山羊是我國具有4000多年飼養(yǎng)歷史的特有珍稀畜種，其主要分布在海拔1500～5000 m的青藏高原、四川西部、甘肅等地，是藏區(qū)人民重要的生活和生產(chǎn)資料，同時藏山羊耐粗飼, 抗逆性強, 肌肉細嫩，風(fēng)味好[11]。因而提高藏山羊甘油轉(zhuǎn)運能力有助于增加其脂肪含量從而提高其肉質(zhì)，而目前對AQP7的研究主要集中于人、大鼠、牛和豬等哺乳動物中，尚未見在山羊中的相關(guān)報道?！颈狙芯壳腥朦c】因此本試驗擬通過RT-PCR方法克隆藏山羊AQP7基因序列，并對序列進行生物學(xué)信息分析，同時利用實時熒光定量PCR技術(shù)(quantitative Real-time PCR，qPCR)闡明其在藏山羊各組織中的表達模式。【擬解決的關(guān)鍵問題】為進一步研究該基因在藏山羊脂代謝中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用試驗動物為來自四川省若爾蓋種羊場的2.5歲健康雄性藏山羊(n=3)，現(xiàn)場屠宰后活體采集各個樣本(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌)，迅速置于液氮中保存帶回實驗室備用。

1.2 試劑

Trizol試劑盒、pMD-19T載體與熒光定量試劑盒SYBRPremix ExTaq(2×)均購自大連TaKaRa公司, 2×LongTaqPCR Master Mix、感受態(tài)細胞DH5α和DNA純化回收試劑盒(Universal DNA Purification Kit)均購自天根生化科技有限公司(北京)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo公司(美國)。

1.3 方法

1.3.1 藏山羊AQP7基因克隆 采用Trizol法提取藏山羊脂肪組織的總RNA，并合成cDNA。根據(jù)GenBank上登陸的牛AQP7基因序列(NM_001076378)，利用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計基因克隆引物(表1)。25 μl PCR擴增體系： 2×GC-Rich PCR MasterMix 12.5 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 9.5 μl。擴增條件：預(yù)變性(94 ℃，3 min)，變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，1 min 10 s)，延伸(72 ℃，1 min)，35個循環(huán)，延伸(72 ℃，10 min)。2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。按照膠回收試劑盒說明書回收純化目的片段，然后將純化的目的片段與pMD-19T載體16 ℃連接2 h，并轉(zhuǎn)化至DH5α細胞中，氨芐抗性平板挑選陽性菌落并進行菌液PCR鑒定，最后送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.2 藏山羊AQP7基因生物信息學(xué)分析 蛋白理化性質(zhì)采用ExPASy ProtParam分析；DNAMAN進行序列比對；磷酸化位點、O糖基化位點、N糖基化位點預(yù)測使用NetPhos3.1、NetOGlyc1.0和NetNGlyc 3.1分析；信號肽應(yīng)用SignaIP 4.1 Server進行分析，跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM預(yù)測，亞細胞定位采用PSORTII進行分析；結(jié)構(gòu)域預(yù)測利用NCBI的Conserved Domain程序進行；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分別運用PRABI、Swiss-model進行；同源性分析采用NCBI中Blast進行，進化樹使用clustalx 1.83和MEGA5.0構(gòu)建。

1.3.3 藏山羊AQP7基因組織表達分析 提取藏山羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌等組織的總RNA，并合成cDNA，根據(jù)克隆測序獲得的AQP7基因序列和3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因設(shè)計特異引物，并利用qPCR技術(shù)檢測AQP7在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌中的相對表達情況。20 μl反應(yīng)體系: SYBR?Premix ExTaqTM(2×)10 μl，cDNA 1 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，RNase Freed H2O 7 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)，每個待測樣本設(shè)2個重復(fù)。用2-ΔΔCt法計算熒光定量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏山羊AQP7 基因克隆

以藏山羊脂肪組織cDNA為模板，通過PCR擴增及2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得預(yù)期相符的目的片段條帶，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序后獲得AQP7基因序列全長1119 bp，包含CDS區(qū)序列993 bp，5’ UTR序列54 bp和3’ UTR序列72 bp，終止密碼子為TAA，編碼330個氨基酸。

表1 引物信息

注：S：正義鏈引物；A：反義鏈引物；GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶。

Note：S: Sense primer; A: Antisense primer; GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

2.2 藏山羊AQP7基因理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam分析藏山羊AQP7蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，藏山羊AQ7蛋白總原子數(shù)為5082，其分子式為C1648H2548N422O447S17，分子量為35.969 kDa，理論等電點為9.2，說明該蛋白呈堿性。帶正電的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為24，帶負電的殘基總數(shù)(Asp + Glu)為18，其不穩(wěn)定系數(shù)為35.77，親水性平均值為0.335，說明該蛋白為穩(wěn)定疏水蛋白。

2.3 藏山羊AQP7基因序列分析

通過DNAMAN比對藏山羊和山羊預(yù)測序列(XM_005684061.3)AQP7基因核苷酸與氨基酸序列同源性發(fā)現(xiàn)，藏山羊與山羊核苷酸同源性分別為99 %，其氨基酸同源性為100 %。檢測到堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致密碼子由TCA變?yōu)門CG，而比對氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸沒有突變。

通過NetPhos3.1、NetOGlyc1.0和NetNGlyc 3.1預(yù)測其磷酸化位點、O糖基化位點和N糖基化位點，結(jié)果顯示藏山羊AQP7蛋白共有31個潛在磷酸化位點，其中絲氨酸(Ser)位點16個，蘇氨酸(Thr)位點13個，酪氨酸(Tyr)位點2個，8個潛在O糖基化位點和4個潛在N糖基化位點。SignaIP 4.1 Server預(yù)測結(jié)果顯示其無信號肽序列，TMHMM結(jié)果顯示其含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域，PSORT II亞細胞定位顯示其主要在質(zhì)膜(47.8 %)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(21.7 %)和液泡(17.4 %)中發(fā)揮作用，STRING分析其蛋白質(zhì)互作，顯示其與AQP6、AQP8、STK4、AQP11、GK、GK2、GK5等存在相互作用(圖1)，同時結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示其含有一個主要內(nèi)在蛋白(MIP)結(jié)構(gòu)域。

通過PRABI軟件預(yù)測二級結(jié)構(gòu)顯示，其主要有α-螺旋，延伸鏈和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)，其有62個氨基酸可能形成阿爾法螺旋，93個氨基酸可能形成延伸鏈和175個氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲。

圖1 藏山羊AQP7蛋白互作Fig.1 Tibetan goat AQP7 protein interaction

2.4 藏山羊AQP7基因氨基酸同源性分析及構(gòu)建進化樹

通過NCBI在線比對氨基酸同源性發(fā)現(xiàn)藏山羊和山羊(XP_005684118)、綿羊(XP_004004192.1)、牛(NP_001069846.1)、虎皮鸚鵡(XP_005143221.1)、豬(NP_001106909.1)、人(NP_001161.1)、野鴨(XP_021131239.1)、羊駝(XP_006216905.1)、獼猴(XP_001100020.1)、家犬(XP_013973284.1)、貓(XP_006939273.1)、斑馬魚(NP_956204.2)、綠海龜(XP_007063361.1)、家鼠(NP_031499.1)，其同源性分別為100 %、99 %、93 %、54 %、77 %、72 %、52 %、78 %、71 %、75 %、76 %、51 %、55 %、71 %。其進化樹結(jié)果表明藏山羊與山羊親緣性最近(圖2)。

圖2 NJ法構(gòu)建藏山羊AQP7氨基酸系統(tǒng)進化樹Fig.2 Construction of phylogenetic tree of AQP7 amino acid system of Tibetan goats by NJ method

n=3；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)n=3;Different superscript lowercase and capital letters respectively showed significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), no obvious difference is indicated by the same letter(P>0.05)圖3 AQP7 mRNA在藏山羊不同組織中的相對表達水平Fig.3 Relative expression levels of AQP7 mRNA in different tissues of Tibetan goats

2.5 藏山羊AQP7基因組織表達分析

組織表達結(jié)果顯示(圖3)，AQP7基因在藏山羊各組織中均有表達，其在脂肪和腎臟組織中的表達量最高，均極顯著高于其他組織(P<0.01)，其次在心臟組織中表達量最高，極顯著高于其他組織(P<0.01)。

3 討 論

近年來，深入研究肌內(nèi)脂肪調(diào)控機制發(fā)現(xiàn)提高肌內(nèi)脂肪含量有助于提高肉的嫩度及多汁性，因此如何提高肌內(nèi)脂肪含量成為研究人員所關(guān)注的熱點。而闡明肌內(nèi)脂肪沉積的分子機制對動物肉品質(zhì)的改善具有重要的理論與實際意義。前人研究表明AQP7基因與脂代謝相關(guān)，因此引起了本實驗室的興趣，而獲得基因序列和闡明其組織表達是研究其功能的基礎(chǔ)，因此本研究擬克隆獲得藏山羊AQP7基因序列和闡明其組織表達譜，進一步揭示AQP7基因在藏山羊脂質(zhì)代謝中的作用提供理論基礎(chǔ)。

本研究獲得AQP7基因序列全長1119 bp，包含CDS區(qū)序列993 bp，編碼330個氨基酸，AQP7含有一個主要內(nèi)在蛋白(MIP)結(jié)構(gòu)域。序列分析顯示，藏山羊AQP7蛋白共有31個潛在磷酸化位點，其中潛在絲氨酸(Ser)位點16個，潛在蘇氨酸(Thr)位點13個，潛在酪氨酸(Tyr)位點2個，8個潛在O糖基化位點和4個潛在N糖基化位點，這可能與蛋白質(zhì)翻譯后修飾有關(guān)[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)AQP7蛋白主要存在于質(zhì)膜中，劉慶雙等[13]對大鼠睪丸AQP7 mRNA與蛋白質(zhì)的定位也發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象，而Kuriyama H等[14]發(fā)現(xiàn)人類AQP7具有6個跨膜結(jié)構(gòu)域，同時本研究也發(fā)現(xiàn)AQP7蛋白含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域，說明AQP7主要在質(zhì)膜中發(fā)揮作用，因而其無信號肽序列。通過比較藏山羊與山羊CDS序列，存在一個同義突變。同時與綿羊和牛CDS序列相比，分別存在3個和22個錯義突變。氨基酸的改變導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其三級結(jié)構(gòu)也證實其二級結(jié)構(gòu)在其之間存在差異，表明AQP7蛋白在不同物種間可能存在差異，而氨基酸改變導(dǎo)致其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是否會引起其功能的變化以及在不同物種間的功能是否有變化仍需進一步證明。

組織表達模式發(fā)現(xiàn)，AQP7在藏山羊各組織中均呈不同程度的表達，其中在脂肪組織和腎臟中表達水平最高，這可能與AQP7在脂肪組織中促進甘油跨細胞膜轉(zhuǎn)運以及在腎臟中對甘油的重吸收有關(guān)[15-16]。Kishida等[17]研究發(fā)現(xiàn)AQP7在小鼠骨骼肌中少量表達，這與本研究結(jié)果相似。王宏麗等[18]發(fā)現(xiàn)高脂肪飲食小鼠脂肪組織AQP7表達下調(diào)，而且其體重及主要脂肪組織增重明顯。Hibuse T等[19]研究發(fā)現(xiàn)AQP7缺乏小鼠心肌甘油消耗和ATP含量顯著降低，提示AQP 7在心肌甘油代謝和ATP生成中具有調(diào)控作用。同時進一步研究發(fā)現(xiàn)肥胖瘦素缺乏ob/ob小鼠骨骼肌AQP7表達與WT小鼠相比顯著增加[3]，表明AQP7可通過多種分子機制調(diào)控脂質(zhì)代謝。根據(jù)本實驗結(jié)果即AQP7在藏山羊脂肪組織中的高水平表達，結(jié)合上述在小鼠等模式生物中的研究，推測AQP7可能在藏山羊的脂代謝、脂肪沉積中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但具體的調(diào)控作用及可能的機制則需進一步研究來闡明。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆包含完整CDS區(qū)序列的藏山羊AQP7基因序列1119 bp，具有跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，主要在質(zhì)膜中發(fā)揮作用；組織表達譜表明AQP7基因廣泛表達于藏山羊各組織中，其在脂肪組織和腎臟組織中表達水平最高。本試驗結(jié)果為研究AQP7基因在藏山羊脂代謝中的作用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。