江華明， 李仁全，彭萬(wàn)仁， 張 波，劉新春，劉松青

(1.四川職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 遂寧 629000；2.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 四川 成都 611130；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】豆科植物能通過(guò)生物固氮為土壤提供氮素，這比化學(xué)肥料更具有可持續(xù)性[1]。 根瘤菌與豆科植物建立共生關(guān)系，并把游離的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨供植物需要。正是由于這個(gè)原因，豆科植物能夠生長(zhǎng)在不同類型的土壤中，即使是在缺氮環(huán)境中也能正常生長(zhǎng)。斜莖黃芪(沙打旺)野生種在我國(guó)東北、華北、西北和西南地區(qū)均有分布。斜莖黃芪根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣泛，是高原草原的優(yōu)良牧草和治沙保土植物。其種子可入藥，為強(qiáng)壯劑，主治神經(jīng)衰弱[2]。斜莖黃芪抗逆性強(qiáng)，其栽培種產(chǎn)草量大，飼用價(jià)值高，對(duì)家畜還有一定的保健作用，是我國(guó)西部生態(tài)環(huán)境治理和發(fā)展畜牧業(yè)的優(yōu)良草種?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)學(xué)者主要對(duì)北方地區(qū)野生斜莖黃芪根瘤菌遺傳多樣性進(jìn)行了研究。高俊蓮等對(duì)來(lái)自北方六省市95株斜莖黃芪根瘤菌菌株進(jìn)行了表型性狀數(shù)值分析研究，結(jié)果表明，全部供試菌株在83 %相似性水平上分為19個(gè)表觀群，顯示出極大的遺傳多樣性，同時(shí)，部分菌株表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗逆性[3]。采用AFLP指紋圖譜分析技術(shù)分析結(jié)果表明，在50 %相似性水平上，全部95個(gè)菌株被分成31個(gè)AFLP群，亦顯示出極大的遺傳多樣性[4]。四川甘孜州位于青藏高原東部。該區(qū)域年均氣溫在5～10 ℃之間，年降水量在400～1000 mm之間，氣候冷涼，降雨較少，晝夜溫差大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究從四川甘孜州5縣(雅江、道孚、康定、爐霍、理塘)8個(gè)采樣點(diǎn)采集到斜莖黃芪植物根瘤 ，將分離純化出的菌株擬通過(guò)BOX-PCR、16S rDNA-RFLP及PCA(Principal Component Analysis)來(lái)分析斜莖黃芪根瘤菌的遺傳多樣性；通過(guò)16SrDNA序列同源性確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位；通過(guò)測(cè)定菌株的耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度范圍來(lái)分析斜莖黃芪根瘤菌的抗逆性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期對(duì)我國(guó)西南地區(qū)，特別是青藏高原橫斷山區(qū)斜莖黃芪根瘤菌的系統(tǒng)進(jìn)化和分類學(xué)地位提供參考。

1 材料與方法

1.1 斜莖黃芪植物根瘤的采集及其根瘤菌的分離和純化

斜莖黃芪植物根瘤及土壤樣品采集自四川甘孜州雅江、道孚、康定、爐霍、理塘等5縣8個(gè)采樣點(diǎn)，同時(shí)觀察記錄了所采集根瘤的形狀及結(jié)瘤部位。

參照Vincent的方法[5]從斜莖黃芪植物根瘤中分離和純化根瘤菌[6]。分離的供試菌株和參比菌株列表1。

表1 斜莖黃芪根瘤菌供試菌株特性及參比菌

續(xù)表1 Continued table 1

菌株Strain宿主Host來(lái)源 (海拔)Origin (Elevation)16S rDNA序列號(hào)Accession No.Max[NaCl] (%) pH范圍pH range溫度(℃) Temperature range SCAU440A.adsurgensBamei, Daofu (3520 m)MK3870866 D4月11日4～37 SCAU446A.adsurgensLuoguoliang, Luhuo(3700 m)24月11日4～50 SCAU447 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK387087 24月11日4～50 SCAU448 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK387088 24月11日4～50 SCAU449A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38708924月10日4～50 SCAU450 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK387090 24月10日4～50 SCAU451 A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38709124月10日4～50 SCAU452A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38709224月10日4～50 SCAU453A.adsurgensLuoguoliang, LuhuoMK38709324月10日4～50 SCAU456A.dsurgens Xiongba, Litang(3640 m)MK38709444月11日4～50 SCAU457A.adsurgensXiongba, LitangMK38709524月10日4～50 SCAU458A.adsurgensXiongba, LitangMK38709644月11日4～50 SCAU461A.adsurgensGaoershi, Yajiang(4100 m)44月11日4～50 M.austylicum WSM2073TBiserrula pelecinusAustraliaM. huakuii CCBAU 2609TAstragalus sinicusNanjing, ChinaR.sullae IS123THedysarum coronariumXinjiang, ChinaS.meliloti ATCC9930TMedicagosativaUSAM.septentrionale SDW014TAstragalus dsurgensLiaoning, ChinaM. temperatum SDW018TAstragalus dsurgensLiaoning, ChinaM.tianshanense CCBAU 3306TGlycyrrhiza llidifloraXinjiang, ChinaM. ciceri ATCC5158TM. amorphae ACCC 19665TCicer arietinumSpainR.leguminosarum USDA2370TAmorpha fruticosaBeijing, ChinaR.etli CFN42TR.leguminosarum 127K17Pisum sativumUSAAg. tumefaciens ATCC 23308TAg. rubi ATCC13335TPhaseolus vulgarisCNPBSPhaseolus sp.USA

注：R:Rhizobium;M:Mesorhizobium;Ag:Agrobacterium; D：Delayed growth and small colonies；4 ℃：Cultured for 30 days.

1.2 菌株生理特性分析

對(duì)30株根瘤菌分別進(jìn)行耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度范圍的測(cè)定[6]。

1.3 遺傳多樣性分析

1.3.1 BOX-PCR指紋分析 參照Little[7]的方法分別提取各菌株的總DNA，并在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?。BOX-PCR的引物序列為:BOXAIR 5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG- 3’[8]。具體操作方法請(qǐng)參見文獻(xiàn)6。

1.3.2 16S rDNA PCR-RFLP指紋圖譜分析 選用正向引物P1(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGAACGCT-3’)和反向引物P6(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)[9]。以各菌株的總DNA為模板來(lái)擴(kuò)增16S rDNA，并選用4種限制性內(nèi)切酶，分別為HaeIII、MspI、HinfI和TaqI。具體操作方法請(qǐng)參見文獻(xiàn)6。

1.4 斜莖黃芪根瘤菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

采用1.3.2 的反應(yīng)體系和程序，分別擴(kuò)增斜莖黃芪根瘤菌的16S rDNA片段，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(1500 bp)后送北京華大基因有限公司測(cè)定序列，用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 回接結(jié)瘤試驗(yàn)

取適量斜莖黃芪種子，用無(wú)菌水浸泡36 h，用75 %酒精處理5 min，再用0.1 % HgCl2處理 3 min，無(wú)菌水漂洗6次，然后浸泡6～8 h。將已表面消毒并浸泡后的種子置于已滅菌的濾紙作墊層的平板中，在2～830 ℃溫箱中萌發(fā)。待種子萌發(fā)至雙葉期(7～10 d)，將幼苗放在菌數(shù)為108個(gè)mL-1的菌液中處理5 min。用已滅菌的鑷子取2株幼苗放置在已滅菌的濾紙與試管壁之間(試管20 mm × 200 mm，內(nèi)盛無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液5 mL)，每個(gè)菌株重復(fù)3個(gè)裝置。將所有裝置放在光照室，每天控制光照時(shí)間14 h，定期補(bǔ)充無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)30 d。觀察各植株結(jié)瘤情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)瘤數(shù)、瘤重。

1.6 數(shù)據(jù)分析和處理

材料間遺傳相似系數(shù)(GS)的計(jì)算采用Nei[10]的方法。在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取斜莖黃芪根瘤菌的序列號(hào)(表1)。具體方法請(qǐng)參見文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜莖黃芪根瘤菌的分離、回接和抗逆性分析

從四川甘孜州5縣8個(gè)采樣點(diǎn)(海拔高度從3190～4100 m)獲得的斜莖黃芪植物根瘤中分離純化出30個(gè)根瘤菌菌株(康定17 株，道孚1株，爐霍8株，理塘3株，雅江1株)，并進(jìn)行回接結(jié)瘤，均能結(jié)瘤。同時(shí)選取了分屬于Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Agrobacterium的14個(gè)參比菌株(表1)。

對(duì)30個(gè)菌株分別進(jìn)行耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度的測(cè)定。結(jié)果表明，在 2 % NaCl的YMA培養(yǎng)基上，30個(gè)供試菌株均能正常生長(zhǎng)。進(jìn)一步測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除9/30的菌株只能耐受 2 % NaCl外，其他菌株中，能在 4 % NaCl及以下的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的占7/30， 能在 6 % NaCl及以下的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的占9/30，有少數(shù)菌株(SCAU409, SCAU415, SCAU423, SCAU433， SCAU 434)還能在 7 % NaCl及以下的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 在全部供試菌株中， 6/30的菌株只能在pH 4～10的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)， 而其余 24/30的菌株都能在pH 4～11的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；20/30的菌株能在4～50 ℃的恒溫條件下生長(zhǎng)，所有菌株能在4～37 ℃和 在60 ℃條件下處理10 min后再置28 ℃條件下生長(zhǎng)(表1)。

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 BOX-PCR指紋及其主成分分析 (PCA) 以各菌株總DNA為模板, BOXAIR(5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’)為引物，對(duì)30株斜莖黃芪供試菌株及14株參比菌株進(jìn)行BOX-PCR，在2 %瓊脂糖凝膠電泳板上得到BOX-PCR指紋圖譜(圖1)。

BOX-PCR聚類分析結(jié)果顯示，斜莖黃芪30個(gè)供試菌株在相似系數(shù)82.4 %水平上分成6個(gè)遺傳群。cluster I：SCAU406，SCAU423；cluster II：SCAU411， SCAU418， SCAU427， SCAU434；cluster III：SCAU456； SCAU458，SCAU 461；cluster IV：SCAU408，SCAU409，SCAU416，SCAU433；cluster V： SCAU447，SCAU448，SCAU449，SCAU450，SCAU451，SCAU452，SCAU453；cluster VI：SCAU412，SCAU415，SCAU417，SCAU419，SCAU440,SCAU428 and SCAU457。除SCAU436與M.septentrionaleSDW 014T；SCAU410與M.temperatumSDW 018T聚群外，其余供試菌株均未與參比菌株聚群 (圖2)。

應(yīng)用NTSYS-pc(V2.10e)軟件對(duì)44個(gè)菌株(斜莖黃芪30個(gè)供試菌株和14個(gè)參比菌株)BOX-PCR的相似系數(shù)進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分所能解釋的相關(guān)性分別為19.93 %、13.72 %和11.82 %，并用EIGEN 程序作主成分之間的三維關(guān)系圖(圖3)。從主成分分析結(jié)果來(lái)看，30個(gè)斜莖黃芪根瘤菌的分群和BOX-PCR聚類結(jié)果基本一致。但在主成分分析結(jié)果中，SCAU 461與R.sullaeIS123聚類成群II；SCAU410與SCAU452聚類成群III；SCAU453進(jìn)入群I；SCAU428與S.meliloti102F28聚成群V；SCAU440，SCAU436進(jìn)入群VI并與M.tianshanenseCCBAU 3306T聚類；另外，SCAU456，SCAU458，SCAU440單獨(dú)分開。

1、SCAU406；2、SCAU408；3、SCAU409；4、SCAU410；5、 SCAU411； 6、SCAU412； 7、SCAU415；8、SCAU416；9、SCAU417； 10、SCAU418；11、SCAU419；12、SCAU423；13、SCAU427；14、SCAU428；15、SCAU433；16、SCAU434；17、SCAU436；18、SCAU440；19、SCAU446；20、SCAU447；21、SCAU448；22、SCAU449；23、SCAU450；24、SCAU451；25、SCAU452；26、SCAU453；27、SCAU456；28、SCAU457；29、SCAU458；30、SCAU 461圖1 斜莖黃芪根瘤菌供試菌株BOX-PCR指紋圖譜Fig.1 BOX-PCR fingerprints for Rhizobia in Astragalus adsurgens(M: 250 bp marker)

圖2 斜莖黃芪根瘤菌供試菌株及參比菌株 BOX-PCR聚類分析圖Fig.2 Dendrogram based on BOX-PCR fingerprints for Rhizobia in Astragalus adsurgens Pall and reference strains

1： SCAU406；2： SCAU408；3：SCAU409；4：SCAU410；5： SCAU411； 6：SCAU412； 7：SCAU415；8：SCAU416；9：SCAU417； 10：SCAU418；11：SCAU419；12：SCAU423；13：SCAU427；14：SCAU428；15：SCAU433；16：SCAU434；17：SCAU436；18：SCAU440；19：SCAU446；20：SCAU447；21：SCAU448；22：SCAU449；23：SCAU450；24：SCAU451；25：SCAU452；26：SCAU453；27：SCAU456；28：SCAU457；29：SCAU458；30：SCAU 461；32：M. huakuii CCBAU 2609T；33: R.sullae IS123；34: S.meliloti 102F28(S.meliloti ATCC9930T); 35: M. septentrionale SDW 014T；36: M. temperatum SDW 018T；37：M.tianshanense CCBAU 3306T；38、C9：M. ciceri USDA 3378T(M. ciceri ATCC5158T)；39：R.leguminosarum USDA2370T； 40：R.etli CFN42; 41：R.leguminosarum 127K17；42：M. amorphae ACCC 19665T； 43：Ag.tumefauensIAM13129T(Ag. tumefaciens ATCC 23308T); 44：Ag. rubi IAM13569T(Ag. rubi ATCC13335T)圖3 斜莖黃芪根瘤菌供試菌株及參比菌株BOX-PCR主成分分析三維圖Fig.3 3-d principal component analysis for BOX-PCR of strains isolated from Astragalus adsurgens and reference strains

2.2.2 16S rDNA PCR-RFLP聚類分析 聚類結(jié)果表明，在83 %的相似性水平上 ，30個(gè)斜莖黃芪根瘤菌菌株聚成3個(gè)遺傳群，而SCAU457，SCAU415，SCAU418，SCAU453則單獨(dú)分開(圖4)。將采用UPGMA 法進(jìn)行聚類分析的結(jié)果轉(zhuǎn)換為協(xié)表征矩陣，對(duì)協(xié)表征矩陣和相似系數(shù)矩陣的相關(guān)性進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)。結(jié)果表明，2 種矩陣顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.884 (P=0.005)，說(shuō)明聚類結(jié)果能較準(zhǔn)確地反映了菌株之間的遺傳關(guān)系。

2.3 斜莖黃芪根瘤菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)30個(gè)斜莖黃芪供試菌株進(jìn)行BOXAIR、16S rDNA-RFLP及PCA的綜合分析后，選擇其中22個(gè)代表菌株的 16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序后建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)果表明， 22個(gè)代表菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖中分成4個(gè)遺傳群：SCAU406、SCAU461、SCAU427、SCAU423、SCAU458、SCAU456、SCAU428、SCAU410、SCAU436等9個(gè)菌株與Rhizobium-Agrobacterium聚群，其中，SCAU428與Rhizobiumsp. CCBAU 65810的相似度為99 %，SCAU436與RhizobiumLMG 23643的相似度為96 %；SCAU447、SCAU448、 SCAU449、SCAU450、SCAU451、SCAU452與Rhizobium聚群，其中，SCAU451與Rhizobiumsp. CCBAU 41184的相似度為88 %(最高)，而與Rhizobiumsp. USDA 1920的相似度為85 %；SCA457與MesorhizobiumlotiATCC 700743T(X67229)聚群但相似度低，與MesorhizobiumlotiNZP2037的相似度(最高)為98 %；其余菌株SCAU408、SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433、SCAU440均與OchrobactrumrhizosphaeraeDSM 19824T聚群，顯示出這7株供試菌株與14個(gè)參比菌株(無(wú)Ochrobactrum參比菌株)均存在一定的差異。這與供試菌株16S rDNA PCR-RFLP聚類結(jié)果基本一致。其中，SCAU412與OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度為97 %，SCAU416與OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度為96 %。 供試菌株16S rDNA序列與已知菌株較低的相似度預(yù)示可能存在潛在的新種。

圖4 斜莖黃芪根瘤菌供試菌株及參比菌株16S rDNA PCR-RFLP聚類Fig.4 Dendrogram based on 16S rDNA PCR-RFLP of the strains isolated from Astragalus adsurgens Pall and reference strains

3 討 論

本研究通過(guò)BOX-PCR、16S rDNA-RFLP及PCA(Principal Component Analysis)、16S rDNA序列同源性分析對(duì)川西高原地區(qū)野生斜莖黃芪根瘤菌的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了系列研究。結(jié)果表明，川西高原地區(qū)(四川甘孜藏族自治州)野生斜莖黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性。30個(gè)菌株分別屬于Rhizobium(11/30 strains)，Ochrobactrum(9/30 strains)，Mesorhizobium(1/30 strains) 和Rhizobium-Agrobacterium(9/30 strains)。斜莖黃芪根瘤菌16S rDNA Simpson遺傳多樣性指數(shù)D=0.954。

本研究采集的斜莖黃芪根瘤來(lái)自海拔3190～4100 m的高寒環(huán)境，土壤含水率多為26.14 %～34.38 %之間，環(huán)境條件特殊。通過(guò)對(duì)30個(gè)斜莖黃芪供試菌株分別進(jìn)行耐鹽性、初始pH生長(zhǎng)范圍及生長(zhǎng)溫度的測(cè)定的結(jié)果(表1)顯示，在 2 % NaCl的YMA培養(yǎng)基上，30個(gè)供試菌株均能正常生長(zhǎng)。其中，能在 4 % NaCl的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的占8/30， 能在 6 % NaCl的YMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的占9/30，另外，尚有少數(shù)菌株(SCAU409，SCAU415，SCAU423，SCAU433，SCAU434)能在 7 % NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。鹽分是影響微生物生長(zhǎng)的最重要的環(huán)境脅迫因素之一。高寒地區(qū)斜莖黃芪根瘤菌大多數(shù)都具有較強(qiáng)的耐鹽性，這很可能是特殊的生態(tài)環(huán)境條件促使根瘤菌產(chǎn)生了積極的適應(yīng)機(jī)制，如積累胞內(nèi)相溶溶質(zhì)谷氨酸和海藻糖來(lái)抵抗高鹽危害[11]這些菌株是寶貴的耐鹽根瘤菌資源，對(duì)改良鹽堿土壤有著積極的意義。 在全部供試菌株中，6/30的菌株能在pH 4～10的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而 24/30的菌株能在pH 4～11的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；20/30的菌株能在4～50 ℃的恒溫條件下生長(zhǎng)，所有菌株能在4～7 ℃和 在60 ℃條件下處理10 min后再置28 ℃條件下生長(zhǎng)。進(jìn)一步表明川西高原地區(qū)野生斜莖黃芪根瘤菌具有較強(qiáng)的適應(yīng)高寒環(huán)境(溫差大，酸堿變化幅度大)的能力。

The tree was constructed by neighbor-joining(NJ) using the Kimura2-parameter model available in the MEGA4.0s of tware, based on the sequences of actinomycetes partial 16S rDNA gene and the reference strains. The scale bar corresponds to 0.01 substitutions per nucleotide position. Number in parentheses represent the sequence accession numbers in GenBank圖5 斜莖黃芪根瘤菌供試菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育圖Fig.5 Phylogenetic tree analysis of 16S rDNA of the strains isolated from Astragalus adsurgens Pall

16S rDNA-RFLP和BOX-PCR是遺傳學(xué)分析中常用的2種方法，均能有效揭示供試生物的遺傳多樣性，但兩種方法相比較而言，16S rDNA-RFLP分析是利用限制性酶切圖譜類型，簡(jiǎn)便快速，常用來(lái)進(jìn)行根瘤菌種內(nèi)遺傳多樣性和種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[12]； 而BOX-PCR是利用根瘤菌基因組中存在的重復(fù)序列來(lái)反映菌株間的遺傳差異，遺傳類型往往具有菌株的特異性[13]。 本研究中，在83 %的相似性水平上，30個(gè)斜莖黃芪根瘤菌菌株在16S rDNA PCR-RFLP聚類分析中聚成3個(gè)遺傳群，而BOX-PCR聚類分析結(jié)果顯示，斜莖黃芪30個(gè)供試菌株在相似系數(shù)82.4 %水平上分成6個(gè)遺傳群，且除SCAU436與M.septentrionaleSDW 014T；SCAU410與M.temperatumSDW 018T聚群外，其余供試菌株均未與參比菌株聚群。應(yīng)用NTSYS-pc(V2.10e)軟件對(duì)44個(gè)菌株(斜莖黃芪30個(gè)供試菌株和14個(gè)參比菌株)BOX-PCR的相似系數(shù)進(jìn)行主成分分析，前3 個(gè)主成分所能解釋的相關(guān)性分別為19.93 %、13.72 %和11.82 %，并用EIGEN 程序作主成分之間的三維關(guān)系圖。結(jié)果表明，30個(gè)供試菌株的主成分分析和BOX-PCR聚類分析結(jié)果基本上一致。但在主成分分析結(jié)果中，SCAU 461與R.sullaeIS123聚類成群II，SCAU410與SCAU452聚類成群III，SCAU453進(jìn)入群I；SCAU428與S.meliloti102F28聚成群V；SCAU440，SCAU436進(jìn)入群VI并與M.tianshanenseCCBAU 3306T聚類，另外，SCAU456，SCAU458，SCAU440單獨(dú)分開。這表明，無(wú)論是通過(guò)16S rDNA-RFLP分析還是BOX-PCR，大部分斜莖黃芪供試菌株與已知菌株均有較大的遺傳差異性，均揭示出川西高原地區(qū)野生斜莖黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性。

22個(gè)代表菌株在16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖中分成4個(gè)遺傳群：SCAU406、SCAU461、SCAU427、SCAU423、SCAU458、SCAU456、SCAU428、SCAU410、SCAU436等9個(gè)菌株與Rhizobium-Agrobacterium聚群，其中，SCAU428與Rhizobiumsp. CCBAU 65810的相似度為99 %，SCAU436與RhizobiumLMG 23643的相似度為96 %；SCAU447、SCAU448、 SCAU449、SCAU450、SCAU451、SCAU452與Rhizobium聚群，其中，SCAU451與Rhizobiumsp. CCBAU 41184的相似度為(最高)88 %，而與Rhizobiumsp. strain USDA 1920的相似度為85 %；SCA457與MesorhizobiumlotiATCC 700743T(X67229)聚群但相似度低，與Mesorhizobiumloti NZP2037的相似度(最高)為98 %；其余菌株SCAU408、SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433、SCAU440均與OchrobactrumrhizosphaeraeDSM 19824T聚群，顯示出這7株供試菌株的遺傳性與14個(gè)參比菌株(無(wú)Ochrobactrum屬參比菌株)均存在較大的差異。這與供試菌株16S rDNA PCR-RFLP聚類結(jié)果基本一致。屬于Rhizobium和Mesorhizobium的多個(gè)斜莖黃芪根瘤菌供試菌株的16S rDNA序列與已知菌株較低的相似度預(yù)示著可能存在潛在的新種[14]。這尚需做進(jìn)一步的功能基因分析。

在已知的研究文獻(xiàn)[3-4]中，斜莖黃芪根瘤菌均屬于Rhizobium和Mesorhizobium。本研究中，30個(gè)菌株分屬4個(gè)屬。其中，首次分離得到9個(gè)屬于Ochrobactrum的菌株?；亟釉囼?yàn)表明，所選菌株SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433能夠結(jié)瘤(但瘤較小)。16S rDNA序列分析中，菌株SCAU408、SCAU409、SCAU412、SCAU416、SCAU419、SCAU433、SCAU440均與OchrobactrumrhizosphaeraeDSM 19824T聚群。其中，SCAU412與OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度最高，為97 %，SCAU416與OchrobactrumanthropiATCC 49188 的相似度為96 %。因此，SCAU412或SCAU416有可能為Ochrobactrum的一個(gè)潛在的新種[14]。

本研究分離純化獲得的斜莖黃芪根瘤菌能為高寒地區(qū)特殊生境優(yōu)良菌株的篩選提供種質(zhì)資源，所作分析能對(duì)我國(guó)西南地區(qū)，特別是青藏高原橫斷山區(qū)斜莖黃芪根瘤菌的系統(tǒng)進(jìn)化和分類學(xué)地位提供一些參考。

4 結(jié) 論

川西高原地區(qū)(四川甘孜藏族自治州)野生斜莖黃芪根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性，大多數(shù)菌株對(duì)高鹽、高溫、低溫及過(guò)酸過(guò)堿環(huán)境均具有很強(qiáng)的耐受能力。

通過(guò)遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在斜莖黃芪根瘤菌供試菌株中可能存在一些新種，因此，需要進(jìn)一步進(jìn)行功能基因分析加以確認(rèn)，以期能豐富根瘤菌物種資源庫(kù)， 為該區(qū)域的生態(tài)恢復(fù)與重建提供優(yōu)良根瘤菌資源。