張 華，郭冬琴，周 濃，潘興嬌，張 杰，羅 靜

(1. 重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120；2. 重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067)

【研究意義】滇重樓(ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.)屬于百合科植物，其是中藥重樓的主要來源植物，以干燥的根莖入藥，具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、止血等重要生物活性。但是滇重樓自然狀態(tài)下其繁殖率極低，現(xiàn)有的野生滇重樓資源難以滿足藥材市場的供求。因此，如何高效栽培滇重樓已成為人們關(guān)注的焦點。叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza，AM)真菌是一類能與許多高等植物根系形成互惠共生體的土壤微生物[1-3]。AM菌根的形成可幫助宿主植物吸收N、P等礦物營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，提高其抗逆性[4-7]，因而被譽為“生物肥料”應(yīng)用于農(nóng)業(yè)化生產(chǎn)及藥用植物栽培；同時AM菌根的形成也會影響植物根際土壤的微生態(tài)環(huán)境。【前人研究進(jìn)展】其中土壤微生物以及土壤酶活性是土壤微生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，是評價土壤肥力、土壤健康狀況的重要指標(biāo)[8-10]，但是很容易受到施肥制度、植被類型、根系分泌物等因子的影響[10-13]?！颈狙芯壳腥朦c】許多研究表明，接種AM真菌有利于提高根際土壤微生物的數(shù)量和土壤酶活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本課題組前期也得到了同樣的實驗證據(jù)[13]，本研究在此基礎(chǔ)上，著重考察AM真菌對室溫盆栽滇重樓幼苗根際土壤微環(huán)境的影響，比較AM真菌施用下幼苗與幼苗根際土壤質(zhì)量的變化，為滇重樓人工栽培中更好的應(yīng)用AM菌劑提供理論指導(dǎo)。

表1 接種不同AM真菌的處理組

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥用植物滇重樓的新鮮種子采自云南省大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院種植基地，并經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定，其為百合科植物滇重樓[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.]成熟種子。用河沙去掉外滇重樓種子果皮，蒸餾水洗凈，之后用10 %次氯酸鈉溶液浸泡15 min，最后蒸餾水洗凈，備用。紫云英種用蒸餾水洗凈，之后用10 %次氯酸鈉溶液浸泡15 min，最后蒸餾水洗凈，備用。

供試AM真菌購自美國國際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心(INVAM)，相應(yīng)AM真菌均為純凈菌劑(表1)。培養(yǎng)基使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離計數(shù)、馬丁培養(yǎng)基進(jìn)行真菌分離計數(shù)、改良高氏Ⅰ號培養(yǎng)基進(jìn)行放線菌分離計數(shù)[14]。

1.2 試驗設(shè)計

試驗土壤采用重慶三峽學(xué)院菜園土與河沙的混合物(體積比為3∶1)，過篩并高壓滅菌。栽培袋經(jīng)10 %次氯酸鈉溶液消毒并用蒸餾水洗凈。選擇飽滿、大小均勻、無病蟲害的滇重樓新鮮種子，將AM菌土(接種劑量每盆5 mL，約60個孢子/1 mL)均勻?qū)邮┯诘嶂貥欠N子的表土下。同時播種紫云英進(jìn)行混合培養(yǎng)，待滇重樓幼苗出土后，除去紫云英植株。共設(shè)計接種28種AM真菌組和CK(對照)組。每種處理10個重復(fù)(盆)，每盆播種滇重樓種子50粒，出苗后間苗20株。接種后置于室溫(自然光照)下培養(yǎng)。生長期間按滇重樓植株的常規(guī)管理進(jìn)行管理。

1.3 根際土壤的采集和處理

于2014年11月12日在各組滇重樓幼苗倒苗后，采取四分法[15]取根系及黏附其上的土壤(根際土)，收集于無菌塑料袋，一部分放保存于4 ℃條件下，用于后續(xù)土壤微生物分離和計數(shù)；剩余一部分風(fēng)干后過篩(1 mm)，用于后續(xù)土壤酶活性的測定。根系冰水浴洗凈，剪為1.0～1.5 cm長的根段，用于后續(xù)菌根侵染率的測定。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 滇重樓菌根侵染率的測定 將滇重樓根系浸泡于FAA固定液中，隨機選取滇重樓根系30條，采用Philips 等[16]的方法進(jìn)行染色、制片及鏡檢等處理，和之后采用Trouvelot等[17]的方法統(tǒng)計菌根侵染率。

1.4.2 土壤微生物的分離及計數(shù) 采用稀釋平板計數(shù)法測定。土壤微生物數(shù)量以菌落數(shù)/克干土的形式表示。

1.4.3 土壤微生物多樣性指數(shù)測定 采用Shannon指數(shù)[18]進(jìn)行測定：H=-ΣPilnPi。式中，Pi為i類群個體數(shù)占總個體數(shù)的比例。

1.4.4 土壤酶活性測定 參照關(guān)松蔭[19]的方法稍加改進(jìn)進(jìn)行土壤酶活性測定，即用離心替代過濾。蛋白酶采用改良茚三酮比色法測定，脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定，過氧化氫酶采用紫外分光光度計法測定，蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定。

1.4.5 土壤微生物生物量碳測定 土壤微生物生物量碳采用氯仿熏蒸K2SO4提取-TOC儀測定法[20]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 及Microsoft Excel 軟件對試驗數(shù)據(jù)分析，并進(jìn)行LSD檢驗和DUNCAN多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓幼苗菌根侵染狀況

菌根侵染率反映AM真菌在宿主植物根內(nèi)的發(fā)育狀況[21]。從圖1可知，28種AM真菌均能與滇重樓幼苗形成菌根共生體，并且與對照相比，各處理組侵染率均顯著提高，侵染率在75.00 %～100.00 %，但各處理組間差異不顯著。

2.2 不同處理對滇重樓幼苗根際土壤微生物數(shù)量的影響

如表2所示，接種不同AM真菌對滇重樓幼苗根際土壤微生物數(shù)量影響存在差異，其中細(xì)菌的數(shù)量在土壤微生物組成中占絕對優(yōu)勢，真菌次之，放線菌居第3。

Ec、Gr和Rfu接種處理后滇重樓幼苗根際土壤微生物總數(shù)量顯著高于CK組。細(xì)菌分布與微生物總量分布一致，不同的AM真菌處理組細(xì)菌的數(shù)量在0.600×106～8.367×106CFU·g-1之間，其中Ec、Gr和Rfu接種處理組顯著高于對照，分別增加了4.40、4.16和3.91倍。其余各組與CK組相比無顯著差異。

不同AM真菌處理組真菌的數(shù)量在2.000×103～16.000×103CFU·g-1之間，與CK組相比，Ako、Atr、Rcl、Rco、Pb、Cc、Dh和Sdi組顯著性增加了根際土壤真菌數(shù)量，分別增加了8.00、6.67、6.50、6.50、6.33、6.33、5.67和5.33倍。其余各組與CK組相比無顯著差異。

接種不同AM真菌處理組放線菌的數(shù)量在1.667×103～14.000×103CFU·g-1之間，Rfu處理組的放線菌數(shù)量顯著高于CK組，增加了4.20倍。其余處理組與CK組相比無顯著差異。

Ec、Rfu和Svi處理組細(xì)菌/真菌顯著高于CK組，分別增加了4.40、1.30、1.27倍；Ec、Gr、Sdi、Gm和Svi處理組的細(xì)菌/放線菌顯著高于CK組，分別增加了3.15、2.77、1.96、1.72、1.24倍；Rfu、Ec、De、Svi和Gd處理組的真菌/放線菌與CK組無顯著性差異，其余處理組均顯著高于CK組，其中Cc處理組真菌/放線菌值最大，增加了12.67倍。以上結(jié)果說明，施加AM真菌可增加宿主植物根際土壤中可培養(yǎng)微生物(細(xì)菌、真菌、放線菌)的數(shù)量，且不同菌劑對不同微生物數(shù)量的影響存在一定差異，可能是由于菌根真菌浸染滇重樓幼苗所形成的叢枝菌根共生體可以分泌促進(jìn)根際土壤微生物的生長與繁殖物質(zhì)。

圖1 不同處理滇重樓幼苗叢枝菌根真菌侵染的影響Fig.1 The mycorrhizal infection rate of Paris polyphylla var. yunnanensis seedlings inoculated by the different AM fungi treatment groups

表2 不同處理對滇重樓幼苗根際土壤微生物數(shù)量的影響

注：表中同列數(shù)據(jù)不同小寫字母表示(P<0.05)水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，下同。

Note: The small letters meant the different columns had statistical significance (P<0.05), and the same as below.

2.3 不同處理對滇重樓幼苗根際土壤微生物多樣性分析

通常一個群落里物種類型數(shù)越多，各類型間分布比例越均勻，說明該群落生物多樣性指數(shù)越高[22]。從圖2可以看出，接種Pb和Ale菌劑可顯著提高滇重樓幼苗根際土壤微生物多樣性指數(shù)，其余菌劑接種后雖與空白相比無顯著性差異，但其中絕大多數(shù)都能夠提高土壤的微生物多樣性指數(shù)，該結(jié)果與課題前期研究歐洪等人[13]的試驗結(jié)果相符。說明AM菌劑是有助于促進(jìn)滇重樓幼苗根際生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的。

2.4 不同處理對滇重樓幼苗根際土壤微生物生物量碳的影響

土壤微生物生物量碳直接或間接地反映土壤肥力的變化以及土壤的同化和礦化能力，其可反映土壤中微生物在的實際含量和作用潛力[23]。由圖3實驗結(jié)果可見，接種AM菌劑有利于提高滇重樓幼苗根際土壤微生物生物量碳，在整個生長周期內(nèi)，Gg、Rco、Rcl、Asp、Ec、Pb和Ale處理組顯著高于CK組。

圖2 接種不同AM真菌處理對滇重樓幼苗根際土壤微生物多樣性指數(shù)的影響Fig.2 The soil microbial diversity index of Paris polyphylla var. yunnanensis seedlings inoculated by the different AM fungi treatment groups

圖3 接種不同AM真菌處理對滇重樓幼苗根際土壤微生物生物量碳的影響Fig.3 The rhizosphere soil microbial biomass carbon of Paris polyphylla var. yunnanensis seedlings inoculated by the different AM fungi treatment groups

2.5 不同處理對滇重樓幼苗根際土壤酶活性的影響

土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)中活躍的生物活性物質(zhì)，在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中起著重要作用，土壤酶參與土壤中一切生物化學(xué)過程[24-26]。表3的數(shù)據(jù)表明，接種不同AM真菌對滇重樓幼苗根際土壤脲酶、磷酸酶、蛋白酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性影響存在顯著性差異，其中土壤脲酶和蛋白酶直接參與土壤含N有機化合物的轉(zhuǎn)化，其活性強度常表征土壤氮素供應(yīng)強度[9]，與CK組相比，Dh和Sde處理組蛋白酶活性顯著高于CK組，Asc和Gr處理組脲酶顯著高于CK組；磷酸酶其活性反映土壤可供有效P潛在能力[26]，從表中數(shù)據(jù)綜合來看，大部分處理組均可以顯著提高土壤磷酸酶活性；過氧化氫酶可催化分解土壤中累積的過氧化氫，從而減輕過氧化氫對植物毒害作用[26]，蔗糖酶促進(jìn)糖類的水解，加速土壤碳素循環(huán)，是土壤中碳循環(huán)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[9]。與CK組相比，5種酶活性的相對增長率由大到小的順序為磷酸酶>蔗糖酶>過氧化氫酶>蛋白酶、脲酶，可見接種AM真菌可顯著增強滇重樓幼苗根際土壤中磷酸酶和蔗糖酶的活性，這與課題前期研究歐洪[13]等人的試驗結(jié)果相符。

表3 接種不同AM真菌處理對滇重樓幼苗根際土壤酶活性的影響

續(xù)表3 Continued table 3

處理組Treatments蛋白酶Protease(mg·kg-1)脲酶Urease(g·kg-1)酸性磷酸酶Acid phosphatase(g·kg-1)中性磷酸酶Neutral phosphatase(g·kg-1)堿性磷酸酶Alkaline phosphatase(g·kg-1)過氧化氫酶Catalase(g·kg-1)蔗糖酶.Sucrase(g·kg-1)Spe0.478±0.020kl3.556±0.116mno0.435±0.008i0.182±0.004j0.131±0.005n0.161±0.002h0.939±0.003hDh2.463±0.013a7.139±0.023ghijkl0.575±0.004f0.215±0.005h0.378±0.008c0.308±0.006de0.682±0.003nRco0.867±0.026fgh9.722±0.032bcde0.179±0.004q0.061±0.002v0.102±0.002o0.100±0.006i1.165±0.004dRfu0.343±0.033l6.722±0.197efghi0.232±0.004p0.244±0.004fg0.119±0.002n0.202±0.015g0.689±0.009nSde1.946±0.034b3.722±0.353lmno0.541±0.003g0.250±0.003f0.198±0.005j0.275±0.011ef0.544±0.007qSvi0.396±0.023l2.278±0.147no0.430±0.005i0.134±0.003l0.524±0.005a0.307±0.006de0.842±0.005iFm0.470±0.020kl6.296±0.321fghijk0.237±0.003p0.094±0.003p0.302±0.002e0.112±0.003i1.015±0.003fCc0.358±0.015l2.963±0.019no0.756±0.008b0.210±0.002h0.523±0.007a0.272±0.008ef1.303±0.009cRcl0.905±0.033fg4.426±0.182hijklm0.283±0.006o0.102±0.002nop0.183±0.003k0.188±0.008gh0.751±0.003lRin0.815±0.020fghi6.241±0.019ghijkl0.575±0.003f0.253±0.003f0.316±0.002d0.514±0.002b0.735±0.007lmAfo0.096±0.008m6.389±0.390fghijk0.186±0.004q0.085±0.002q0.100±0.005o0.293±0.002def0.692±0.016nAko0.366±0.008l1.352±0.291o0.301±0.009n0.106±0.002no0.152±0.002m0.090±0.008i0.807±0.020jkAsc0.403±0.015l13.019±0.409a0.355±0.011l0.099±0.002op0.079±0.003p0.189±0.004gh1.331±0.005bAsp1.437±0.042d10.537±0.406bc0.372±0.002k0.119±0.002m0.218±0.002hi0.309±0.006de0.616±0.004pDe1.002±0.013ef4.074±0.067klmno0.346±0.003l0.291±0.003d0.241±0.007g0.298±0.019def0.542±0.003qDs0.575±0.026ijkl6.556±0.580efghi0.588±0.003f0.238±0.005g0.305±0.003de0.289±0.008ef0.692±0.005nEc0.358±0.008l7.482±0.792defghi0.295±0.009no0.561±0.006a0.128±0.002n0.299±0.005def0.817±0.007jPb0.695±0.033ghijk6.500±0.500efghij0.421±0.006i0.052±0.002w0.076±0.004p0.287±0.009ef1.087±0.005ePo0.455±0.072kl7.296±0.037defghi0.457±0.005h0.116±0.002m0.268±0.003f0.327±0.004cd0.481±0.003qAle0.500±0.015jkl7.907±0.019cdefg0.685±0.005c0.179±0.003j0.169±0.002l0.304±0.004de0.740±0.005lmAtr0.763±0.020fghij10.333±0.085bcd0.396±0.004j0.137±0.002l0.155±0.002m0.287±0.002ef1.731±0.004aCK1.661±0.033c8.417±0.023cdefg0.230±0.005p0.075±0.002u0.124±0.002n0.266±0.006f0.791±0.004k

3 討 論

土壤微生物數(shù)量和酶活性是影響土壤微生態(tài)環(huán)境的重要因素[11]。其中土壤微生物是土壤生物活性最敏感的指標(biāo)之一，它們的種類、數(shù)量及其變化反映了土壤肥力以及各種養(yǎng)分的存在狀態(tài)，直接影響著土壤的供肥狀況[26]。近年來一些學(xué)者的研究表明接種AM菌劑能使除大田作物而外的藥用植物根際土壤中微生物數(shù)量增加及土壤酶活性升高，從而促進(jìn)土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化及吸收[2,8,11,13]來表現(xiàn)出利于植物生長的生態(tài)效應(yīng)，是一種值得推廣的生物菌肥。本實驗從微生態(tài)的角度，通過對滇重樓幼苗接種28種AM菌劑，采集樣品測定滇重樓幼苗菌根浸染率、土壤微生物數(shù)量、生物量碳及土壤酶活性。研究結(jié)果表明接種AM 真菌能促進(jìn)土壤中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量增加及多樣性、生物量碳增加，土壤根際酶活性，尤其是可顯著增強滇重樓幼苗根際土壤中磷酸酶、蔗糖酶的活性，該結(jié)果與歐洪[13]等人的試驗結(jié)果相近似。

本研究中，三大菌群的數(shù)量以細(xì)菌數(shù)量在土壤微生物組成中占絕對優(yōu)勢，真菌次之，放線菌居第3。說明接種AM真菌對滇重樓幼苗根際土壤中細(xì)菌的數(shù)量影響最大，細(xì)菌成為優(yōu)勢菌群，提高了人工栽培土壤的肥力，這一變化規(guī)律雖沒有歐洪[13]等人試驗的整體趨勢明顯，但大體趨勢上是一致的。本實驗結(jié)果還表明與對照組相比，添加AM菌劑能顯著提高滇重樓幼苗根際土壤酶活性(磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、蛋白酶、脲酶)，尤其可顯著增強磷酸酶、蔗糖酶的活性，這與歐洪[13]等人的研究結(jié)果一致。

可見，接種不同的AM真菌對滇重樓幼苗根際土壤微環(huán)境影響存在差異，該研究也為今后滇重樓人工栽培中更好的篩選和應(yīng)用AM菌劑提供理論指導(dǎo)。