王珂，石繼紅，魏振衡

缺氧是腦卒中、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┖蛧乐氐脱獕旱燃膊」餐牟±硪蛩?，心肌缺氧后可引起心肌細胞氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等，使心肌出現(xiàn)功能障礙和壞死等損傷，進而導致各種心臟疾病的發(fā)生。大量研究表明[1-3]，缺氧可引起微小RNA（miRNAs）的變化，進而影響miRNAs在心肌細胞損傷和凋亡過程中的調(diào)控作用。miR-30a是miR-30家族中的重要成員，在多種細胞的生長發(fā)育、細胞增殖和凋亡等生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與腫瘤、代謝性疾病和心血管疾病等的發(fā)生密切相關[4-6]。有研究指出[7]，缺氧可引起心肌細胞中miR-30a的表達升高，但miR-30a在缺氧條件下心肌細胞凋亡過程中的作用及其機制并不明確。我們通過構建缺氧心肌細胞模型，脂質體轉染上調(diào)miR-30a表達，探討miR-30a對心肌細胞凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清和轉染試劑Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，miR-30a mimics及其陰性對照購于美國Ambion公司。β肌動蛋白（β-actin）、信號轉導與轉錄因子3（STAT3）、p-STAT3和切割型活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved caspase-3）抗體購于美國Trevigen公司，辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗兔/鼠IgG抗體購于美國CTS公司。DMEM培養(yǎng)基、電化學發(fā)光（ECL）化學發(fā)光劑和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司。逆轉錄試劑盒和實時定量試劑盒購于中國Takara Biotechnology公司，總蛋白提取試劑盒購于北京索來寶公司。超氧化物歧化酶（SOD）含量檢測試劑盒購于南京森貝伽公司，丙二醛（MDA）含量試劑盒購于北京吉美生物公司，乳酸脫氫酶（LDH）含量試劑盒購于上海紀寧公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉染和處理 將購于中科院上海細胞庫的大鼠心肌H9C2細胞解凍復蘇后，采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于5%CO2和95%O2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。參照楊艷等[7]發(fā)現(xiàn)的miR-30a在缺氧條件下上調(diào)，且在24 h處達峰值的結果。我們采用厭氧低糖DMEM培養(yǎng)基于5%CO2和95%N2條件下培養(yǎng)H9C2細胞24 h后，再在5%CO2和95%O2的條件正常培養(yǎng)，以構建缺氧細胞模型。收集對數(shù)生長期的H9C2細胞，將其隨機分為對照組：不做任何處理；缺氧組：缺氧處理24 h；缺氧+NC組：轉染miR-30a陰性對照24 h后，給予缺氧處理24 h；缺氧+miR-30a組：轉染miR-30a mimics 24 h后，給予缺氧處理24 h。其中，待H9C2細胞融合度達80%左右時，參照Lipofectamine 2000試劑說明書步驟轉染miR-30a陰性對照和miR-30a mimics。每組實驗設置3個重復。按照實驗分組處理48 h后，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 實時定量PCR檢測 采用Trizol法提取H9C2細胞的總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒說明書步驟逆轉錄合成PCR模板鏈cDNA。參照試劑盒步驟進行PCR擴增。其中，miR-30a引物（F:5’-GGCTTGTAAACATCCTCGAC-3’，R:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’）和U6引物（F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’，R:5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’）由美國Invitrogen公司合成。PCR擴增條件：94℃ 180s（1個循環(huán)）、94℃ 30s（30個循環(huán)）、60℃ 30s（30個循環(huán)）、72℃ 30s（30個循環(huán)）和72℃300 s（1個循環(huán)）。以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算各組細胞中miR-30a的相對表達量。

1.4 SOD、LDH和MDA含量檢測 將1.2中的細胞處理48 h后，收集各組細胞上清液。分別根據(jù)試劑盒說明書步驟檢測SOD、MDA和LDH含量。結果以重復3次的平均值表示。

1.5 MTT檢測 取對數(shù)生長期H9C2細胞，胰酶消化后制備濃度為4.5×104個/ml的細胞懸液，以每孔200 μl接種至96孔細胞板上。按照1.2中的分組處理細胞后，加入MTT試劑（濃度為5 mg/ml）20 μl，常溫孵育4h后棄培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μl，結晶充分溶解后，采用酶標儀在492 nm波長處檢測各組細胞的吸光度值，并以實驗組的吸光度值和對照組的吸光度值的百分比表示細胞存活率。

1.6 流式細胞儀檢測 將收集到的H9C2細胞沉淀，以磷酸緩沖液洗滌后，加入Binding buffer 200 μl重懸細胞，再于避光條件下加入Annexin-V-FITC 5 μl和PI 10 μl雙染色15 min后，上流式細胞儀檢測H9C2細胞的凋亡率。

1.7 Western blot檢測 按照提取試劑盒步驟裂解H9C2細胞提取總蛋白后，BCA法對總蛋白濃度的進行定量。取蛋白樣本30 μg與上樣緩沖液混合后，95℃下變性10 min。采用微量移液器將蛋白樣品上樣至SDS聚丙烯酰胺凝膠。60V恒壓電泳至分離膠后，以120V恒壓電泳。1h后結束電泳，采用300 mA恒流轉膜1 h。使用以TBST配制的濃度為5%脫脂奶粉于37℃下封閉2 h。再在4℃下加入1:1000的一抗（包括STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3抗體）稀釋液反應24 h后，以TBST溶液洗膜3次，每次10 min。再于37℃下加入1:3000稀釋的HRP標記的山羊抗兔/鼠IgG抗體反應2 h。再次洗膜后，加入ECL試劑顯色。以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）形式表示，多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中miR-30a表達水平的比較 缺氧組中miR-30a表達水平較與對照組明顯升高（P＜0.05）；與缺氧組相比，缺氧+miR-30a組中miR-30a的表達明顯升高（P＜0.05），而缺氧+NC組未見明顯變化（P＞0.05）。可見，缺氧條件下可誘導miR-30a表達升高；轉染miR-30a mimics能夠明顯增強缺氧誘導的miR-30a表達（表1）。

2.2 各組細胞中SOD、LDH 和 MDA水平的比較 缺氧組細胞上清液中SOD含量較對照組明顯降低（P＜0.05），而LDH和MDA含量較對照組明顯升高（P＜0.05）。與缺氧組相比，缺氧+NC組中SOD、LDH和MDA含量差異無顯著性（P＞0.05）；而缺氧+miR-30a組中SOD含量顯著降低（P＜0.05），而LDH和MDA含量顯著升高（P＜0.05）?？梢姡险{(diào)miR-30a表達可加重缺氧誘導的心肌細胞損傷（表2）。

表1 各組H9C2細胞中miR-30a表達水平的比較（±s）

表1 各組H9C2細胞中miR-30a表達水平的比較（±s）

注：NC：陰性對照；miR-30a：微小RNA-30a；與對照組比較，aP＜0.05；與缺氧組比較，bP＜0.05

組別 miR-30a對照組 1缺氧組 2.86±0.22a缺氧+NC組 2.92±0.37缺氧+miR-30a組 5.57±0.45b F值 109.338 P值 0.000

2.3 各組細胞活力的比較 各組H9C2細胞的存活率總體比較差異顯著（P＜0.05）。缺氧組與對照組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，H9C2細胞的存活率明顯降低（P＜0.05）；缺氧+NC組與缺氧組比較，H9C2細胞的存活率無顯著性差異（P＞0.05）；而缺氧+miR-30a組與缺氧組比較，H9C2細胞的存活率明顯降低（P＜0.05）。上調(diào)miR-30a表達可增強缺氧對心肌細胞增殖的抑制作用（表3）。

表2 各組H9C2細胞上清液中SOD、LDH 和 MDA水平的比較（±s）

表2 各組H9C2細胞上清液中SOD、LDH 和 MDA水平的比較（±s）

注：NC：陰性對照；miR-30a：微小RNA-30a；與對照組比較，aP＜0.05；與缺氧組比較，bP＜0.05

組別 SOD/kU L-1LDH/U L-1MDA/mol L-1對照組 23.26±1.3221.05±1.388.56±0.16缺氧組 12.15±1.28a54.72±2.15a21.28±3.24a缺氧+NC組 12.38±1.0552.16±2.5223.16±2.78缺氧+miR-30a組 8.42±0.75b71.36±3.45b31.54±3.28b F值 97.443 213.266 37.300 P值 0.000 0.000 0.000

表3 各組H9C2細胞存活率和凋亡率的比較（±s）

表3 各組H9C2細胞存活率和凋亡率的比較（±s）

注： NC：陰性對照；miR-30a：微小RNA-30a；與對照組比較，aP＜0.05；與缺氧組比較，bP＜0.05

組別 存活率（%） 凋亡率（%）對照組 100 2.51±0.15缺氧組 63.25±3.55a 13.18±1.02a缺氧+NC組 65.18±2.86 12.88±1.35*缺氧+miR-30a組 47.54±1.62b 19.68±2.02b F值 251.073 86.821 P值 0.000 0.000

2.4 各組細胞凋亡的比較 各組H9C2細胞的凋亡率差異顯著（P＜0.05）。與對照組相比，缺氧組細胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05）；缺氧+NC組與缺氧組間無顯著差異（P＞0.05），但缺氧+miR-30a組細胞的凋亡率明顯高于缺氧組（P＜0.05）。結果表明，上調(diào)miR-30a表達可促進缺氧誘導的H9C2細胞凋亡（圖1，表3）。

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡的結果

2.5 各組細胞中cleaved caspase-3、p-STAT3和STAT3蛋白表達的比較 各組之間cleaved caspase-3和p-STAT3蛋白的表達差異顯著（P＜0.05），而STAT3蛋白的表達差異不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，缺氧組細胞中cleaved caspase-3和p-STAT3蛋白的表達水平均明顯升高（P＜0.05）；缺氧+miR-30a組中cleaved caspase-3和p-STAT3蛋白的表達水平顯著高于缺氧組（P＜0.05），而缺氧+NC組與缺氧組間無顯著差異（P＞0.05）?？梢?，上調(diào)miR-30a表達可增強缺氧誘導的STAT3信號通路的活化（圖2，表4）。

圖2 Western blot檢測cleaved caspase-3、p-STAT3和STAT3蛋白的表達結果

表4 各組H9C2細胞中cleaved caspase-3、p-STAT3和STAT3蛋白的相對表達水平（±s）

表4 各組H9C2細胞中cleaved caspase-3、p-STAT3和STAT3蛋白的相對表達水平（±s）

注： NC：陰性對照；miR-30a：微小RNA-30a；與對照組比較，aP＜0.05；與缺氧組比較，bP＜0.05

組別 c l e a v e d c a s p a s e-3 p-S T A T 3 S T A T 3對照組 0.3 2±0.0 2 0.1 8±0.0 2 0.6 4±0.0 5缺氧組 0.5 7±0.0 4 a 0.3 6±0.0 2 a 0.6 7±0.0 5缺氧+N C組 0.5 5±0.0 6 0.3 3±0.0 3 0.6 9±0.0 6缺氧+m i R-3 0 a組 0.7 6±0.0 6 b 0.5 6±0.0 5 b 0.6 6±0.0 5 F值 4 2.3 4 8 6 9.7 8 6 0.4 6 9 P值 0.0 0 0 0.0 0 0 0.7 1 2

3 結論

miR-30a作為miRNAs的重要成員，與腎臟和腦等多種組織損傷關系密切[8,9]。miR-30a過度表達可加重糖氧剝奪誘導的神經(jīng)細胞死亡，減少其表達后可通過上調(diào)HSPA5水平或增強beclin 1介導的自噬減弱腦缺血性損傷[10,11]。miR-30a在心肌細胞中廣泛表達，在心肌纖維化、心肌肥大和心肌損傷等病變過程中發(fā)揮著重要的功能[12-15]。老年急性心肌梗死患者血清中或體內(nèi)缺氧后，心肌細胞中miR-30a高度聚集，miR-30a可通過抑制外泌體釋放維持缺氧后的自噬[16,17]。心力衰竭患者中高表達的miR-30a可通過下調(diào)Gab1表達抑制心肌細胞增殖、誘導細胞凋亡[18]。我們以大鼠心肌H9C2細胞為研究對象，缺氧處理H9C2細胞24 h后檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧可引起H9C2細胞中miR-30a表達升高，細胞活力減弱，細胞凋亡增強；轉染miR-30a mimics上調(diào)miR-30a表達后能夠明顯增強缺氧引起的上述作用。提示在缺氧條件下，miR-30a在心肌細胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮著積極的作用。

心肌缺氧損傷除了與心肌細胞增殖和凋亡有關外，還伴隨著氧化應激反應的發(fā)生[19]。在細胞氧化應激過程中，細胞膜會受到損害，使其通透性發(fā)生改變，胞內(nèi)的糖降解酶LDH外漏，導致細胞功能異常；MDA是脂質過氧化產(chǎn)物，其水平的高低可間接反映細胞內(nèi)的氧化水平；SOD為氧自由基清除劑，在細胞抗氧化防御過程中發(fā)揮著重要作用。我們通過檢測H9C2細胞中LDH、MDA和SOD的含量來反應缺氧對心肌細胞的損傷及miR-30a對心肌細胞氧化應激反應的影響。結果發(fā)現(xiàn)，缺氧處理后，H9C2細胞上清液中SOD含量降低，LDH和MDA含量升高，表明缺氧可導致心肌細胞氧化應激反應的發(fā)生；上調(diào)miR-30a表達后，H9C2細胞上清液中SOD含量進一步降低、LDH和MDA含量進一步升高，表明miR-30a能夠明顯增強缺氧誘導氧化應激反應。提示缺氧條件下，miR-30a在心肌細胞氧化應激反應中發(fā)揮著重要的促進作用。STAT3是廣泛分布于生物體內(nèi)的信號轉導因子，屬于STAT家族成員，其磷酸化后可通過與多種基因相互作用共同調(diào)控細胞的增殖和凋亡等生物學行為；STAT3在缺氧所致的心肌細胞損傷過程中發(fā)揮著積極作用，抑制其活化可升高SOD、降低LDH和MDA含量發(fā)揮抗氧化應激作用，減輕缺氧所致心肌損傷[20]。Caspase-3是公認的與細胞凋亡有關的蛋白，其在是caspase級聯(lián)反應中發(fā)揮著執(zhí)行因子的作用，活化后以cleaved caspase-3形式出現(xiàn)。有研究指出[21,22]，STAT3的激活可增加肌肉C2C12細胞caspase-3活性，miR-30a可激活STAT3信號增加B細胞淋巴瘤小鼠的MDSC分化和免疫抑制功能，但miR-30a有無介導STAT3信號通路參與缺氧誘導的心肌細胞凋亡并不清楚。為了進一步探討miR-30a促進缺氧誘導的心肌H9C2細胞凋亡的分子機制，我們檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-30a表達能夠明顯促進缺氧誘導的STAT3磷酸化和caspase-3活化。提示miR-30a可通過激活STAT3信號通路促進缺氧誘導的心肌細胞凋亡。

綜上所述，miR-30a可通過激活STAT3信號通路增強氧化應激損傷，促進缺氧誘導的細胞凋亡。這一結果為闡明缺氧所致疾病的發(fā)病機制提供了參考依據(jù)，也為進一步針對性預防和治療缺氧所致疾病提供了新的線索。