鄒普越 曹楚林 胡瀚丹

研究背景

渦蟲（圖1）具備超強(qiáng)的再生能力。1898年，遺傳學(xué)家摩爾根切下了渦蟲整體重量1/279的小塊組織，后來這個(gè)小塊組織再生為了一個(gè)完整的個(gè)體。渦蟲因此被譽(yù)為“切不死的動(dòng)物”。近年研究發(fā)現(xiàn)，渦蟲驚人的再生能力與其體內(nèi)豐富的干細(xì)胞密切相關(guān)，渦蟲受到創(chuàng)傷引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，隨后通過相關(guān)信號(hào)調(diào)動(dòng)體內(nèi)干細(xì)胞的遷移、增殖與分化等生理過程。

應(yīng)激蛋白HSP90是原核和真核生物細(xì)胞中與創(chuàng)傷、刺激和生長(zhǎng)相關(guān)的重要基因。本研究推測(cè)，渦蟲被切割后，組織缺失作為一種刺激引起渦蟲應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致HSP90高表達(dá)，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以探究HSP90對(duì)渦蟲再生能力的調(diào)控作用。

研究過程

實(shí)驗(yàn)通過喂食渦蟲HSP90的dsRNA（圖2），干擾渦蟲基因表達(dá)，再用熒光定量qPCR方法檢測(cè)渦蟲再生及神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)情況。圖3所示為實(shí)驗(yàn)主要流程示意圖。

研究結(jié)果與分析

HSP90是調(diào)控渦蟲個(gè)體再生能力大小的關(guān)鍵基因

渦蟲被切斷后HSP90表達(dá)量明顯增加：我們利用qRNA技術(shù)定量分析HSP90的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，渦蟲切后6h和12h，HSP90的表達(dá)量明顯增加，達(dá)到對(duì)照組的2倍左右;在切后24h，表達(dá)量恢復(fù)如初。我們推測(cè)，HSP90作為創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白，它的表達(dá)量升高可能對(duì)渦蟲再生過程的啟動(dòng)具有至關(guān)重要的作用。

dsRNA干擾渦蟲HSP90的表達(dá)：為研究渦蟲再生過程中HSP90的可能作用，我們利用RNAi技術(shù)，通過喂食dsRNA干擾HSP90表達(dá)，看渦蟲再生過程是否受到影響。喂食dsRNA3次后的第3天，qPCR檢測(cè)可以看出干擾組渦蟲HSP90表達(dá)量明顯比對(duì)照組低，差異極顯著（P<0.001），說明dsRNA成功干擾了HSP90的表達(dá)。

干擾HSP90后渦蟲再生能力明顯降低：成功干擾HSP90表達(dá)3天后，將渦蟲在咽前切為2段，不同時(shí)間分別觀察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組渦蟲頭部和尾部再生情況，并拍照記錄。與對(duì)照組相比，干擾組眼點(diǎn)再生時(shí)間延遲了24h，且干擾組再生6天，也沒有形成有耳突的典型頭部形態(tài);尾部再生過程中，干擾組渦蟲再生6h創(chuàng)傷面也未能收縮，胚基形成少，再生6天時(shí)，也沒有形成完整個(gè)體，尾部比對(duì)照組短了1～2mm;從渦蟲再生過程中長(zhǎng)/寬比值變化也發(fā)現(xiàn)，渦蟲再生速度減慢。

干擾HSP90后影響了渦蟲體內(nèi)干細(xì)胞的增殖能力

渦蟲再生需要體內(nèi)干細(xì)胞增殖分化，我們推測(cè)，渦蟲再生速度減慢可能是因?yàn)镠SP90被干擾后，導(dǎo)致渦蟲體內(nèi)干細(xì)胞增殖能力降低。

增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是渦蟲成體干細(xì)胞增殖的一個(gè)標(biāo)志基因，表達(dá)時(shí)期與DNA合成時(shí)期一致。因此，檢測(cè)PCNA的表達(dá)，可評(píng)價(jià)干細(xì)胞增殖狀態(tài)。

我們?cè)跍u蟲切后6h和72h，檢測(cè)PCNA表達(dá)量。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾組和對(duì)照組PCNA表達(dá)量在6h和72h都有升高，干擾組渦蟲干細(xì)胞PCNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。這一結(jié)果說明，HSP90在被干擾表達(dá)后，渦蟲再生能力降低是因?yàn)轶w內(nèi)干細(xì)胞增殖減少的緣故。

HSP90是調(diào)控渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷修復(fù)能力的關(guān)鍵基因

為了探究HSP90被干擾后，渦蟲再生過程中神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷修復(fù)是否受到影響，我們利用一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白的抗體標(biāo)記渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)，免疫熒光組化實(shí)驗(yàn)顯示渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷修復(fù)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，再生0h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)再生情況無明顯差異;再生2天時(shí)，對(duì)照組渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的再生，受損的神經(jīng)系統(tǒng)前、后端再生良好，而HSP90干擾組渦蟲受損神經(jīng)系統(tǒng)再生遲緩;再生6天時(shí)，對(duì)照組渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)再生完全，再生的腦神經(jīng)節(jié)前端和腹神經(jīng)素末端能正常閉合。而HSP90干擾組渦蟲再生的腦神經(jīng)節(jié)前端未能完全閉合，尾部再生6天，再生的腹神經(jīng)素末端也沒能完全閉合。

討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用體外轉(zhuǎn)錄HSP90的dsRNA，將其與食物混合后喂食渦蟲，干擾渦蟲體內(nèi)HSP90的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)干擾組渦蟲在切后6h仍不能及時(shí)做出應(yīng)激反應(yīng)收縮創(chuàng)傷面;對(duì)照組渦蟲再生2天后，頭部就再生出眼點(diǎn)，而干擾組渦蟲在再生后的第3天，頭部才再生出小小的眼點(diǎn);從咽前切斷后，對(duì)照組渦蟲6天完成再生，而HSP90干擾組渦蟲6天內(nèi)并不能再生為完整個(gè)體。此外，通過比較渦蟲再生不同時(shí)間長(zhǎng)/寬比值，發(fā)現(xiàn)干擾組渦蟲在切后雖然可以再生，但再生速率明顯低于對(duì)照組。渦蟲獨(dú)特的再生魅力源于其體內(nèi)干細(xì)胞增殖，通過檢測(cè)PCNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)干擾HSP90后，渦蟲體內(nèi)干細(xì)胞增殖減少，說明干擾組渦蟲再生能力的降低與其體內(nèi)干細(xì)胞增殖減少密切相關(guān)。

這些結(jié)果說明，干擾HSP90的表達(dá)后，渦蟲再生能力明顯降低，HSP90是調(diào)控渦蟲再生能力大小的關(guān)鍵基因。本實(shí)驗(yàn)中，我們首次發(fā)現(xiàn)，干擾HSP90后，渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)再生修復(fù)能力降低，HSP90是調(diào)控渦蟲神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷修復(fù)能力的關(guān)鍵基因。

綜上所述，我們可以初步得出結(jié)論，HSP90作為應(yīng)激蛋白，在渦蟲創(chuàng)傷后的早期應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用;干擾HSP90后，影響了渦蟲的再生應(yīng)答，致使渦蟲個(gè)體再生及神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷修復(fù)能力大大降低。因此，HSP90是渦蟲再生過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，并在神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中有潛在應(yīng)用價(jià)值。

由于HSP90是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的分子，加之調(diào)控渦蟲干細(xì)胞增殖分化的相關(guān)基因及信號(hào)分子在人類及其他哺乳動(dòng)物中都很保守，因此我們推測(cè)，HSP90調(diào)控渦蟲再生的研究結(jié)果很可能適用于人或其他動(dòng)物。比如，將HSP90用于受損的組織或器官可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。不僅如此，針對(duì)HSP90，用渦蟲篩選調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)再生的藥物，將很有可能用于人類神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)。實(shí)現(xiàn)人體組織或器官的再生，也許將不再是夢(mèng)！