張杰 許風國
摘要:通過對野生鐵皮石斛的定向誘導和逐步馴化,篩選適合液體懸浮生長的鐵皮石斛原球莖,并對其ITS(內(nèi)轉錄間隔區(qū))和Rbcl進行分子鑒定。在此基礎上,建立了適合鐵皮石斛原球莖快速生長的液體培養(yǎng)體系,對蛋白、多糖、醇浸出物、金屬含量等成分進行檢測分析。結果發(fā)現(xiàn),以1/2MS+2.0 mg/L KT(激動素)+0.5 mg/L NAA(萘乙酸)+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L馬鈴薯提取物為鐵皮石斛原球莖液體培養(yǎng)基,經(jīng)5周液體培養(yǎng),采收原球莖(318.3±22.5) g/L(鮮質(zhì)量),平均生長率為(9.7±0.59) g/(L·d)(鮮質(zhì)量),單個最大鮮質(zhì)量為23.7 g,多糖含量為(19.09±1.05)%,醇浸出物含量為(37.82±3.50)%,蛋白質(zhì)含量為42.51%,其中精氨酸含量高達19.23 mg/g,鉛、鎘、砷、汞、銅等金屬含量遠低于最高限定標準。結果表明,采用該液體培養(yǎng)體系,可培育生產(chǎn)出高產(chǎn)和高生物活性的鐵皮石斛。
關鍵詞:鐵皮石斛;原球莖;液體培養(yǎng);ITS; Rbcl
鐵皮石斛(Dendrobium candidum)是一種珍稀中草藥,具有生津養(yǎng)胃、抗衰老、抗疲勞、降血糖、保肝護肝、抗腫瘤和增強免疫力等作用[1-4]。在自然環(huán)境條件下,野生鐵皮石斛對生存環(huán)境要求苛刻,種子萌發(fā)需要共生菌等作用[5],加上毫無節(jié)制過度采集,野生鐵皮石斛已被列為瀕危物種[6]。目前廣泛采用傳統(tǒng)方式種植鐵皮石斛中草藥,但這種種植培育方式不僅需占用大量土地,培育周期長達3年,農(nóng)藥殘留和重金屬污染普遍嚴重,不同種石斛混合種植時,易造成異花傳粉和雜交變種,而且種植使用大量無機化肥,易造成環(huán)境污染和品質(zhì)下降等問題。為解決鐵皮石斛這種傳統(tǒng)珍稀中草藥種植所面臨的問題,培育品質(zhì)純正、無污染、高生物產(chǎn)量和高生物活性的鐵皮石斛,本研究利用植物組織培養(yǎng)技術,建立了一種新型液體培養(yǎng)體系,培育生產(chǎn)高質(zhì)量和高生物活性鐵皮石斛珍稀中草藥,可直接轉化到鐵皮石斛中試進行大規(guī)模商業(yè)化培育生產(chǎn)。
1 材料與方法
1.1 鐵皮石斛的定向誘導和液體培養(yǎng)體系
1.1.1 鐵皮石斛愈傷組織誘導 試驗于2015年在江蘇省蘇州市進行。以浙江雁蕩山野生鐵皮石斛莖段為外植體,消毒處理,在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的固體瓊脂培養(yǎng)基上進行愈傷組織細胞誘導,培養(yǎng)溫度為 25 ℃,采用全光譜LED(發(fā)光二極管)燈,光—暗周期12 h—12 h,光照度1 800 lx。
1.1.2 鐵皮石斛原球莖的誘導和液體懸浮馴化 以鐵皮石斛愈傷組織細胞為材料,在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D+2%蔗糖的固體瓊脂培養(yǎng)基上定向誘導原球莖的產(chǎn)生。在1/2MS+2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭的固體瓊脂培養(yǎng)基上,可實現(xiàn)原球莖的快速生長增殖。將鐵皮石斛原球莖轉接到1/2MS+2%蔗糖液體培養(yǎng)基中,逐步懸浮馴化,篩選適合液體懸浮生長的鐵皮石斛原球莖新品系。培養(yǎng)環(huán)境條件均為25 ℃,采用全光譜LED燈,光—暗周期12 h—12 h,光照度1 800 lx。
1.1.3 鐵皮石斛液體培養(yǎng)體系 將適合液體懸浮生長的鐵皮石斛原球莖新品系培育在1/2MS+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.6%甘露糖+30 g/L馬鈴薯提取物的液體培養(yǎng)基中,將盛有液體培養(yǎng)基的三角瓶滅菌,于100 r/min懸浮液體培養(yǎng),室溫25 ℃,光質(zhì)5 ∶ 1 LED紅藍光,光照度 2 500 lx,光—暗周期12 h—12h,液體培養(yǎng)5周。
1.2 鐵皮石斛分子鑒定和系統(tǒng)進化分析
采用NCBI BLAST在線軟件對鐵皮石斛ITS和rbcL序列進行比對分析,并從NCBI下載相關ITS和rbcL序列用于構建系統(tǒng)樹。用MEGA 7.0構建鄰接系統(tǒng)樹,采用Clusta lW序列比對,系統(tǒng)樹自檢1 000次。
1.3 鐵皮石斛營養(yǎng)成分檢測和分析
1.3.1 多糖含量測定 鐵皮石斛原球莖干品和鐵皮楓斗粉碎過100目篩,100 ℃熱水回流,浸提2 h,離心過濾,取上清。上清液直接采用二硝基水楊酸(DNS)法[9]測定總糖(C總糖)、還原糖(C還原糖)和多糖含量(C多糖)。
C多糖=C總糖-C還原糖。
(1)
以葡萄糖為標準品,制作測定標準曲線,為y=1.981x-0.092 5,r2=0.992。
1.3.2 醇浸出物含量測定 根據(jù)2015年版《中國藥典》醇溶性浸出物測定方法[10],采用熱浸法測定鐵皮石斛原球莖干品和鐵皮楓斗的醇浸出物含量。
1.3.3 氨基酸營養(yǎng)成分測定 根據(jù)國家食品氨基酸測定方法[11],采用OPA/FMOC(鄰苯二醛/9-芴甲基氯甲酸甲酯)全自動柱前分析-AminoQuant氨基酸分析法測定鐵皮石斛原球莖氨基酸成分組成。
1.3.4 金屬元素含量測定 根據(jù)2010年版《中國藥典》元素檢測分析方法[12],采用安捷倫電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Agilent 7500ce ICP-MS)對鐵皮石斛原球莖進行元素含量的檢測分析。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析
采用Origin 8.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析。
2 結果與分析
2.1 鐵皮石斛的定向誘導和懸浮馴化
以野生鐵皮石斛莖段為材料,在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2%蔗糖的瓊脂固體培養(yǎng)基中,經(jīng)45 d誘導培養(yǎng),產(chǎn)生黃綠色顆粒狀愈傷組織(圖1-A)。將愈傷組織轉接到含有0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D+2% 蔗糖的1/2MS固體培養(yǎng)基上,經(jīng)40 d誘導,會形成 6~8 mm 鐵皮石斛原球莖(PLB)。為實現(xiàn)原球莖在固體培養(yǎng)基上的快速生長,則可采用在1/2MS固體培養(yǎng)基中添加 2.0 mg/L KT+2%蔗糖+500 mg/L 活性炭(圖2-B)的方法進行快速增殖培養(yǎng)。