熊流新 陸麗苗

[摘要]目的 探討肺炎克雷伯菌臨床分布特征及檢測其碳青霉烯酶基因型，為完善本院分子流行病學(xué)資料提供理論依據(jù)。方法 對2015年1月～2017年12月本院患者送檢的臨床標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，采用BIOFOSUN微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏分析，采用WHONET5.6進(jìn)行臨床分布及耐藥性分析;對亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌進(jìn)行改良碳青霉烯類失活法試驗(yàn)（mCIM），PCR法檢測碳青霉烯酶3種基因型（blaKPC、blaNDM、blaIMP），擴(kuò)增產(chǎn)物使用BLAST軟件分析;對mCIM試驗(yàn)結(jié)果與PCR結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。結(jié)果 共分離888株肺炎克雷伯菌，標(biāo)本來源主要是痰液595株（67.0%）、尿液86株（9.7%）、分泌物80株（9.0%）、血液71株（8.0%）;科室分布主要是新生兒科147株（16.6%）、呼吸科107株（12.0%）、普兒科103株（11.6%）、神經(jīng)外科89株（10.0%）及ICU 73株（8.2%）。肺炎克雷伯菌對大多數(shù)抗菌藥物存在不同程度的耐藥，耐藥率低于15%的只有亞胺培南、美羅培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦。對30株（3.4%）亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌進(jìn)行mCIM試驗(yàn)，其中陽性29株（敏感性為96.7%）;30株亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌中有7株擴(kuò)增陽性，檢出均為blaNDM基因型（敏感性為23.3%），mCIM試驗(yàn)結(jié)果與PCR結(jié)果一致性Kappa值為0.766;與此同時(shí)無檢出blaKPC、blaIMP基因型。結(jié)論 blaNDM基因型是本院肺炎克雷伯菌產(chǎn)碳青霉烯酶主要型別及對亞胺培南耐藥的主要機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]肺炎克雷伯菌;碳青霉烯酶基因型;改良碳青霉烯類失活法;NDM基因型

[中圖分類號] R978.11? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）7（c）-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the clinical distribution of Klebsiella pneumonia and detect its carbapenemase genotypes， so as to provide a theoretical basis for improving the molecular epidemiological data of our hospital. Methods The clinical specimens sent to our hospital from January 2015 to December 2017 were isolated and cultured. The BIOFOSUN microbial identification drug sensitivity analysis system was used for bacterial identification and drug sensitivity analysis. The clinical distribution and drug resistance analysis were analyzed by WHONET5.6. The Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae was tested by modified carbapenem inactivation method （mCIM）， and three carbapenemase genotypes （blaKPC， blaNDM， blaIMP） were detected by PCR， PCR products were analyzed by BLAST software. The consistency of results between mCIM tests results and amplification results was analyzed by using BLAST software. The consistency test between the mCIM test results and the PCR results was performed. Results A total of 888 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated. The specimens were mainly 595 strains （67.0%） from sputum， 86 strains （9.7%） from urine， 80 strains （9.0%） from secretion， and 71 strains （8.0%） from blood. The departmental distribution was mainly 147 strains （16.6%） in neonatology， 107 strains （12.0%） in respiratory， 103 strains （11.6%） in pediatrics， 89 strains （10.0%） in neurosurgery， and 73 strains （8.2%） in ICU. Klebsiella pneumoniae was resistant to most antimicrobial agents in varying degrees， only Imipenem， Meropenem， Amikacin and Piperacillin/Tazobactam with antimicrobial resistance rates below 15%. All 30 （3.4%） strains of Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae were tested by mCIM， and 29 strains were positive （the sensitivity was 96.7%）. Seven of the 30 strains of Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae were positively amplified， and all of them were detected as blaNDM genotype （sensitivity was 23.3%）. The Kappa value for consistency of mCIM tests results and PCR results was 0.766， at the same time blaKPC or blaIMP genotypes were not detected. Conclusion The blaIMP is the major genotype of carbapenemase in our hospital and the main mechanism for Imipenem-resistant Klebsiella pneumoniae.

[Key words] Klebsiella pneumoniae; Carbapenemase genotypes; Modified carbapenem inactivation method; NDM genotype

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是革蘭陰性桿菌，屬于腸桿菌科的重要成員，可引起肺炎、敗血癥及泌尿系統(tǒng)感染等[1]。隨著臨床大量使用廣譜抗生素，多重耐藥肺炎克雷伯菌（multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae，MDRKP）菌株導(dǎo)致的臨床抗感染治療的困擾已經(jīng)被廣泛報(bào)道。魏澤慶等[2]研究表明，MDRKP感染有著較高的發(fā)病率和死亡率，是院內(nèi)感染患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與此同時(shí)，MDRKP感染可以引起醫(yī)院感染小范圍的流行，其不斷增長趨勢引起了臨床的極大關(guān)注[3-4]。MDRKP感染患者的臨床治療藥物選擇存在諸多限制，碳青霉烯類抗菌藥物被認(rèn)為是臨床治療革蘭陰性桿菌感染的最后一道防線[5]。在抗生素選擇性壓力下，KPN可以通過基因突變獲得耐藥質(zhì)粒并攜帶多種耐藥基因?qū)咕幬锂a(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)碳青霉烯酶是耐碳青霉烯酶類抗菌藥物最突出的機(jī)制[6]。碳青霉烯酶可分為A、B、D三種，其中A、D類屬于絲氨酸酶（包括KPC、IMI、NMC-A、SME等），B類屬于金屬酶（包括NDM、IMP、VIM、SIM等）。碳青霉烯酶可以直接水解滅活大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類（包括碳青霉烯酶類）和多種非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，產(chǎn)碳青霉烯酶KPN（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）菌株在近年全球多個(gè)國家及地區(qū)檢出率呈上升的趨勢，使臨床抗感染治療受到巨大挑戰(zhàn)[7]。為了及時(shí)監(jiān)測KPN分布特征及碳青霉烯類基因型流行狀況，本研究對本院分離的888株KPN進(jìn)行臨床分布及耐藥性進(jìn)行分析，并對其中30株CRKP采用mCIM試驗(yàn)及PCR法檢測3種常見的碳青霉烯酶基因型（blaKPC、blaNDM、blaIMP），現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源? 收集2015年1月～2017年12月本院的888株KPN，排除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株，本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2質(zhì)控菌株及儀器? BIOFOSUN微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)購自上海復(fù)興醫(yī)藥有限公司;抗菌藥敏紙片購自O(shè)XOID公司;LB肉湯、TSB肉湯、血平板、Mueller-Hinton Agar（MHA）平板購自廣州迪景公司;Omega小抽試劑盒購自美國Omega生物科技公司;PCR儀器購自Bio-Rad公司;質(zhì)控菌株：KPN ATCC700603、大腸埃希菌ATCC25922、大腸埃希菌ATCC35218均購自廣東省臨床檢驗(yàn)中心;產(chǎn)碳青霉烯酶菌株17Kpe17（ST型431）來源于肇慶市疾病控制中心惠贈(zèng)。

1.2方法

1.2.1臨床分布及藥敏分析? 細(xì)菌分離培養(yǎng)嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行，采用BIOFOSUN微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)。采用WHONET5.6軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)菌藥敏標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CLSI-100M-S27文件進(jìn)行判斷。

1.2.2 mCIM試驗(yàn)檢測KPN中的碳青霉烯酶? 將耐亞胺培南的30株KPN株編號S1-S30，從-70℃冰箱取出復(fù)蘇，按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行mCIM試驗(yàn)。mCIM試驗(yàn)結(jié)果解釋：美羅培南紙片抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，證明紙片中的美羅培南被碳青霉烯酶降解，表現(xiàn)為無抑菌圈或抑制大腸埃希菌ATCC25922的活性降低，即判斷為陽性;美羅培南紙片抑菌圈直徑≥19 mm，紙片中的美羅培南不被碳青霉烯酶水解，仍能抑制大腸埃希菌ATCC25922的生長，即判斷為陰性;美羅培南紙片抑菌圈直徑為16～18 mm，或直徑為≥19 mm抑菌圈內(nèi)有散在菌落，即判斷為中介。

1.2.3 PCR法檢測碳青霉烯酶基因型? 參照文獻(xiàn)[9]基因序列設(shè)計(jì)blaKPC、blaNDM、blaIMP基因引物，由上海生工生物工程有限公司合成，具體見表1。參考Omega小抽試劑盒提取DNA作為PCR反應(yīng)模板，具體步驟參照說明書及相關(guān)文獻(xiàn)[10]，PCR反應(yīng)體系為25 μl（2×PCR Mix 12.5 μl，上下引物各1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O加至25 μl），PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min，94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR完成后吸取5 μl至1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（恒壓100 V），電泳60 min后，在凝膠成像儀下觀察不同的泳道blaKPC（798 bp）、blaNDM（621 bp）、blaIMP（232 bp）是否存在特異性條帶。將PCR陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序，測序后序列采用DNA Star軟件校正，登陸NCBI官網(wǎng)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列對比分析。

1.2.4 mCIM試驗(yàn)與PCR結(jié)果一致性統(tǒng)計(jì)分析? Kappa值<0.40代表一致性程度較差;Kappa值在0.40～0.75代表一致性程度一般;Kappa值>0.75代表一致性程度較好。

2結(jié)果

2.1 KPN臨床分布

2015年1月～2017年12月本院送檢標(biāo)本檢出KPN 888株，其中2015年243株，2016年258株，2017年387株，呈現(xiàn)逐年上升趨勢;在送檢標(biāo)本中，主要是痰液（67.0%）、尿液（9.7%）、分泌物（9.0%）、血液（8.0%），膿液及其他標(biāo)本也有檢出，具體見表2。KPN科室主要分布于新生兒科147株（16.6%）、呼吸科107株（12.0%）、普兒科103株（11.6%）、神經(jīng)外科89株（10.0%）、ICU 73株（8.2%），其他科室也有不同程度檢出，具體見表3。KPN對大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生一定程度耐藥，耐藥率低于15%的只有亞胺培南、美羅培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦，具體見表4。其中CRKP 30株（3.4%），2015年4株，2016年13株，2017年13株。

2.2 mCIM試驗(yàn)結(jié)果

對30株CRKP進(jìn)行mCIM試驗(yàn)，共檢出29株mCIM試驗(yàn)結(jié)果陽性（敏感性為96.7%）（圖1）;其中1株CRKP mCIM實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性（編號S17），該菌落特征為高黏液表型，菌液極難調(diào)制，導(dǎo)致mCIM實(shí)驗(yàn)陰性的具體原因有待進(jìn)一步研究（陰性對照為KPN ATCC700603，陽性對照菌株產(chǎn)碳青霉烯酶菌株17Kpe17，ST型431）。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

30株CRKP中有7株P(guān)CR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物大少與blaNDM產(chǎn)物大少基本一致（621 bp）（圖2）。PCR陽性產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行雙向測序，測序后序列與GenBank已報(bào)道的序列進(jìn)行對比，證實(shí)是blaNDM基因。30株CRKP均無擴(kuò)增出blaKPC、blaIMP預(yù)期片段。對編號S17的CRKP菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3種碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP）均為陰性。

2.4 mCIM試驗(yàn)結(jié)果與PCR結(jié)果一致性檢驗(yàn)

對30株（3.4%）亞胺培南耐藥的KPN進(jìn)行mCIM試驗(yàn)，其中陽性29株（敏感性為96.7%）;30株CRKP有7株擴(kuò)增陽性，檢出均為blaNDM基因（敏感性23.3%）。mCIM試驗(yàn)與PCR結(jié)果一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.766，一致性程度較好。

3討論

本研究結(jié)果顯示，2015年1月～2017年12月本院KPN檢出率呈現(xiàn)上升趨勢，并存在部分科室聚集的現(xiàn)象。主要集中于新生兒科（16.6%）、呼吸科（12.0%）、普兒科（11.6%）、神經(jīng)外科（10.0%）和ICU（8.2%），標(biāo)本來源主要是痰液（67.0%）、血液、分泌物、尿液及其他標(biāo)本也有一定分布。KPN是導(dǎo)致呼吸道相關(guān)感染的重要條件致病菌，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。本研究結(jié)果還顯示，KPN對大多數(shù)抗菌藥物存在不同程度的耐藥，耐藥率<15%的抗菌藥物只有亞胺培南、美羅培南、阿米卡星及哌拉西林/他唑巴坦，但與此同時(shí)個(gè)別抗菌藥物耐藥性有下降趨勢，如阿米卡星從2015年的耐藥率為10.0%，2016年的耐藥率為5.8%，2017年的耐藥率為1.0%;左旋氧氟沙星2015年的耐藥率為20.7%，2016年的耐藥率為20.5%，2017年的耐藥率為10.6%。陳淼等[12]研究表明，細(xì)菌臨床分布及其耐藥性在不同的地區(qū)有著不同的特點(diǎn)，這與該醫(yī)院常用抗菌藥物的使用強(qiáng)度、侵入性治療開展情況和當(dāng)?shù)厝巳旱囊赘行缘纫蛩孛芮邢嚓P(guān)。近年本院推行了嚴(yán)格的抗菌藥物分級管理，定期組織臨床藥師開展臨床一線查房并對重點(diǎn)患者實(shí)施藥學(xué)監(jiān)護(hù)，院感部門對耐藥菌群進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測和對多重耐藥菌定植或感染的患者進(jìn)行隔離治療，對指導(dǎo)臨床合理使用抗生素和切斷耐藥菌傳播途徑有著積極的意義。

本研究結(jié)果提示，對亞胺培南耐藥KPN共30株（3.4%），采用mCIM試驗(yàn)同時(shí)結(jié)合PCR法檢測碳青霉烯酶3種基因型（blaKPC、blaNDM、blaIMP），其中mCIM試驗(yàn)結(jié)果陽性共29株（敏感性為96.7%），PCR結(jié)果陽性顯示有7株，產(chǎn)物大少與blaNDM大少（621 bp）基本一致，將PCR產(chǎn)物送上海生工有限公司進(jìn)行雙向測序并與GenBank已報(bào)道的序列對比，最終證實(shí)是blaNDM基因。7株P(guān)CR擴(kuò)增陽性的菌株，mCIM試驗(yàn)結(jié)果均為陽性。對mCIM試驗(yàn)結(jié)果和PCR試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，兩者一致性較高（Kappa值為0.766）。mCIM試驗(yàn)具有操作簡單、所需耗材少和結(jié)果可靠等特點(diǎn)，可以作為臨床微生物室CRKP常規(guī)篩查手段。本研究中1株CRKP（編號S17），菌落形態(tài)為高黏液表型，mCIM試驗(yàn)與PCR結(jié)果均為陰性。Goodman等[13]研究分析，該菌可能為非產(chǎn)碳青霉烯酶型菌株，由于存在AmpC酶伴外膜蛋白缺失、外排泵高表達(dá)及親和性結(jié)合位點(diǎn)缺失等因素造成的結(jié)果。

KPN是醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌，可以通過接觸、空氣等多種途徑傳播，MDRKP的感染流行已經(jīng)成為全球關(guān)注的重大衛(wèi)生安全問題[14]。臨床不合理使用抗菌藥物可誘導(dǎo)KPN菌株產(chǎn)生耐藥性，KPN的耐藥機(jī)制包括質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、氨基糖苷類修飾酶滅活作用、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶導(dǎo)致抗菌藥物作用靶位改變、細(xì)菌對抗菌藥物的外排機(jī)制及細(xì)菌的生物膜形成等，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是KPN對碳青霉烯類耐藥的主要原因[15]。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)ESBLs的KPN菌株同時(shí)對碳青霉烯類耐藥，編碼耐碳青霉烯類耐藥基因與編碼產(chǎn)ESBLs耐藥基因并存，這給臨床抗感染治療帶來極大考驗(yàn)。自2009年Timothy R. Walsh教授研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道NDM基因后，許多國家和地區(qū)都有相關(guān)的報(bào)道，NDM基因可通過質(zhì)粒在不同細(xì)菌間傳播，產(chǎn)生的碳青霉烯酶能直接水解亞胺培南等抗菌藥物，稱為“NDM超級耐藥菌”，已經(jīng)引起臨床的高度關(guān)注[16-17]。本研究結(jié)果檢出均為blaNDM基因型，與謝思等[18]研究的廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院以攜帶KPC-2型基因型為主結(jié)果不同。本研究通過調(diào)查CRKP患者流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，30株中有11株的患者有曾經(jīng)到外地三甲醫(yī)院住院治療的經(jīng)歷，這11株CRKP在肇慶地區(qū)流行傳播所起的作用仍需進(jìn)一步研究分析。

終上所述，本院KPN檢出率呈現(xiàn)逐年增高趨勢并散發(fā)出現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，攜帶blaNDM基因型碳青霉烯酶是本院KPN對亞胺培南耐藥的重要機(jī)制。臨床應(yīng)該對此情況予以高度重視，嚴(yán)格控制碳青霉烯類抗菌藥物的使用，以防止此類菌株越來越多。

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（收稿日期：2019-04-01? 本文編輯：任秀蘭）