王倩穎，常鵬杰，申亞梅，張 超，董 彬，時(shí)寶柱

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.奈曼旗橋河國(guó)有母樹(shù)林經(jīng)營(yíng)林場(chǎng)，內(nèi)蒙古 通遼 028300）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好及高通量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析的相關(guān)研究中［1-2］。但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，目的基因的表達(dá)結(jié)果經(jīng)常受RNA的提取質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄合成效率等的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差［3］，因此需要引入內(nèi)參基因?qū)虮磉_(dá)結(jié)果進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化以消除背景誤差的影響［4］。理想的內(nèi)參基因是指在不同的組織，不同時(shí)期，不同環(huán)境條件下甚至是不同植物下皆可相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的基因。它們是構(gòu)成細(xì)胞的基本轉(zhuǎn)錄組成分，參與維持細(xì)胞的基本功能，且與要分析的目標(biāo)基因具有相似的表達(dá)水平［5］。但大量實(shí)驗(yàn)研究表明，許多內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)因?yàn)橹参锏陌l(fā)育階段或?qū)嶒?yàn)條件的不同而出現(xiàn)差異，這種差異會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至得出錯(cuò)誤的結(jié)論［6-7］。因此，在進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)前，選擇合適的內(nèi)參基因變得尤為重要。景寧木蘭Magnolia sinostellata是木蘭科Magnoliaceae木蘭屬M(fèi)agnolia新種，落葉灌木，先花后葉，花色艷麗，花瓣數(shù)量9～18瓣，觀賞價(jià)值極高，分布于浙江南部地區(qū)海拔1000 m以上的區(qū)域，是浙江省特有種，屬于極度瀕危物種［8］。景寧木蘭性喜溫涼濕潤(rùn)、水分充足的環(huán)境，但隨著全球氣候變暖，城市熱島效應(yīng)的加劇，高溫環(huán)境嚴(yán)重影響著植物的生長(zhǎng)。目前對(duì)景寧木蘭的研究集中在花色和花芽分化的轉(zhuǎn)錄組分析上［9］，抗逆性研究鮮有報(bào)道。通常情況下，采用遮陽(yáng)等措施來(lái)降低高溫對(duì)景寧木蘭的傷害，但植物自身的抗熱脅迫的遺傳特性才是起決定作用的因素。因此，研究景寧木蘭對(duì)高溫脅迫的抗逆機(jī)制，解析其響應(yīng)高溫的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有針對(duì)性地發(fā)掘相關(guān)抗性基因，對(duì)景寧木蘭的保護(hù)、分子育種有積極的意義。目前，尚未見(jiàn)到基于qRT-PCR技術(shù)篩選景寧木蘭內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以熱脅迫下景寧木蘭1年生實(shí)生苗的根、莖、葉組織為材料，選取13個(gè)內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和geNorm，NormFinder和BestKeeper等3個(gè)表達(dá)分析軟件篩選熱脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為景寧木蘭熱脅迫下相關(guān)目的基因的表達(dá)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用的植物材料為種植于浙江農(nóng)林大學(xué)苗圃?xún)?nèi)景寧木蘭1年生實(shí)生苗。選取長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病蟲(chóng)害的植株16盆，分別置于2個(gè)人工氣候箱內(nèi)（POX-1000A-12H），氣候箱光合光子照度為800 μmol·m-2·s-1，濕度控制在75%～80%，溫度分別為25℃（對(duì)照）和40℃（高溫處理），光周期為12 h/12 h。分別在處理24和48 h時(shí)采取根、葉片和莖段，在液氮中速凍后于-80℃中保存，用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成 將凍存的樣品在液氮中研磨成粉后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑提取材料的總RNA，通過(guò)質(zhì)量濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性， 紫外分光光度計(jì)來(lái)檢測(cè) RNA 的純度［D（260）/D（280）=1.8～2.1， D（260）/D（230）＞1.8］及質(zhì)量濃度［終質(zhì)量濃度（mg·L-1）=D（260）×n×40。 其中， D（λ）為波長(zhǎng) λ 處的吸光度， n 為稀釋倍數(shù)］。 全長(zhǎng) cDNA 第 1條鏈的合成按照PrimeScriptTM RT Master Mix（Takara，大連）試劑說(shuō)明書(shū)操作，將得到的cDNA在-20℃保存。

1.2.2 候選內(nèi)參基因及定量引物設(shè)計(jì) 從前期構(gòu)建的景寧木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，選取13個(gè)功能基因作為候選內(nèi)參基因的熒光定量PCR引物。引物信息見(jiàn)表1。

表1 13個(gè)候選內(nèi)參基因和目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of the 13 candidate reference genes and target genes

1.2.3 內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增程序 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋10倍，使用SYRB Premix Ex TapⅡ（Takara，大連）實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，在Light Cycler 480Ⅱ（Roche）實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為 SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10.0 μL， cDNA 模板 2.0 μL， 上下游引物各 0.8 μL（10 μm·L-1）， 雙蒸水（ddH2O）6.4 μL，共20.0 μL體系。每個(gè)樣品3次重復(fù)，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃預(yù)變性30 s，共40個(gè)循環(huán)，然后60～95℃持續(xù)15 s作為溶解曲線分析程序。

1.2.4 引物擴(kuò)增效率的計(jì)算 將12個(gè)樣品的cDNA等量混合作為模板，按照5倍梯度稀釋產(chǎn)物，共5個(gè)梯度進(jìn)行熒光定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用公式E=（10-1/K-1）×100%計(jì)算得出內(nèi)參引物的擴(kuò)增效率。其中E為擴(kuò)增效率，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。R2=（總平方和-殘差平方和）/總平方和，總平方和為標(biāo)準(zhǔn)曲線中響應(yīng)濃度Ct的實(shí)際值與平方值的平方差之和，殘差平方和為相應(yīng)濃度下Ct的估計(jì)值與實(shí)際值的平方差之和［10］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析和處理 利用geNorm，NormFinder和BestKeeper 3個(gè)軟件分析13個(gè)候選內(nèi)參基因在不同處理下不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，從而得到熱脅迫下景寧木蘭表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因。其中，BestKeeper軟件直接通過(guò)計(jì)算Ct對(duì)每個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行分析；geNorm和NormFinder將Ct根據(jù)公式Q=ECtmin-Ctsample進(jìn)行轉(zhuǎn)化，式中E為擴(kuò)增效率，當(dāng)其接近100%時(shí)，默認(rèn)為2進(jìn)行計(jì)算［11］；Ctmin為該基因在所有組織中的最小Ct；Ctsample為該基因在各個(gè)組織中的Ct。

2 結(jié)果與分析

2.1 景寧木蘭RNA的質(zhì)量檢測(cè)

提取的RNA條帶清晰，沒(méi)有彌散片狀或條帶消失的現(xiàn)象，說(shuō)明RNA完整性良好，且沒(méi)有降解。景寧木蘭RNA樣品的D（260）/D（230）皆約2.0，＞1.8，說(shuō)明RNA純度較高，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 景寧木蘭候選內(nèi)參基因引物特異性及擴(kuò)增效率檢測(cè)

將12個(gè)樣品的cDNA等量混合，按照10倍梯度稀釋產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行普通PCR和定量PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：13個(gè)引物的產(chǎn)物只有單一條帶，無(wú)可見(jiàn)引物二聚體，且13個(gè)引物的溶解曲線都只有明顯的單一峰，說(shuō)明引物的特異性良好。計(jì)算擴(kuò)增效率結(jié)果顯示：擴(kuò)增效率為97.36%～110.91%，UBC最高，GADPH最低，相關(guān)系數(shù)R2為0.990～0.999（表2）。符合qRT-PCR試驗(yàn)的要求。

表2 候選內(nèi)參基因擴(kuò)增特性Table 2 Candidate reference genes amplification specificity

2.3 景寧木蘭候選內(nèi)參基因表達(dá)水平分析

利用比較Ct的方法評(píng)估13個(gè)候選內(nèi)參基因在不同處理下平均表達(dá)水平（圖 1）。18S的Ct最小，為4.601，平均表達(dá)水平最高；余下12個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct為15.869～23.072，表達(dá)水平相差不大。

圖1 候選內(nèi)參基因不同組織中的CtFigure 1 Candidate reference genes Ctvalues in different tissues

2.4 景寧木蘭候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

geNorm軟件根據(jù)計(jì)算得到的平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定性排序，M越大表明基因越不穩(wěn)定，以M=1.5為標(biāo)準(zhǔn)，M＜1.5認(rèn)為是理想內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，該軟件還通過(guò)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化的配對(duì)差異分析（Vn/Vn+1）來(lái)得到內(nèi)參基因的合適數(shù)量，軟件默認(rèn)以Vn/Vn+1=0.15為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Vn/Vn+1＜0.15時(shí)，表明n個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)可以穩(wěn)定作為內(nèi)參基因，沒(méi)必要引入第n+1個(gè)基因［12］。通過(guò)圖2可知：13個(gè)基因的M為0.0500～0.2000，＜1.5，說(shuō)明13個(gè)候選內(nèi)參基因都達(dá)到了作為內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)，其中ACTIN-7和EF-1α最為穩(wěn)定，M=0.33449。GADPH的M最大，為1.14166，是所有候選內(nèi)參基因中表達(dá)最不穩(wěn)定的。圖3表明：V2/V3為0.021＜0.15，說(shuō)明2個(gè)基因可穩(wěn)定作為內(nèi)參基因，結(jié)果可靠，無(wú)需引入第3個(gè)基因。進(jìn)一步分析表明：ACTIN-7和EF-1α為最佳內(nèi)參組合。

BestKeeper軟件通過(guò)計(jì)算內(nèi)參基因Ct的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）對(duì)內(nèi)參基因的的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，標(biāo)準(zhǔn)偏差越小表明內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，如果標(biāo)準(zhǔn)偏差＞1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定［8］。表3顯示：在不同組織中，NADP和GADPH的標(biāo)準(zhǔn)偏差大于1，說(shuō)明這2個(gè)基因表達(dá)不穩(wěn)定。余下的11個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差皆小于1，其中UBC，EF-1α，ACTIN-7和GTB穩(wěn)定性最好，排名最高。

NormFinder軟件通過(guò)計(jì)算組內(nèi)和組間的方差得到表達(dá)穩(wěn)定值，并對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行排序，穩(wěn)定值越小，表明內(nèi)參基因越穩(wěn)定。表3顯示：UBQ，EF-1α和TEF分別排在前3位，表達(dá)穩(wěn)定值較為接近，表達(dá)最為穩(wěn)定；CYP的穩(wěn)定值最大，為0.237，表達(dá)穩(wěn)定性最差。

圖2 geNorm軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值Figure 2 Reference genes expression stability by geNorm

圖3 geNorm軟件分析內(nèi)參基因配對(duì)變異值Figure 3 Reference genes pairwise variation value by geNorm

表3 BestKeeper和NormFinder軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性及排名Table 3 Reference genes expression stability and ranking by BestKeeper and NormFinder

2.5 景寧木蘭候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性驗(yàn)證

綜合以上3個(gè)軟件分析的結(jié)果，本研究選擇了穩(wěn)定性較好的3個(gè)基因（UBC，EF-1α和ACTIN-7）和1個(gè)基因組合（EF-1α和ACTIN-7）。通過(guò)分析CSLD3和KOR基因在景寧木蘭不同組織的表達(dá)模式來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。CSLD3是植物合成根毛細(xì)胞壁的重要纖維素合成酶基因，可以引起細(xì)胞壁形成的缺陷［13］。研究表明此基因在根部中表達(dá)最高［14］。KOR基因是植物合成細(xì)胞壁中發(fā)揮重要作用的纖維素合成酶基因，在莖中和木質(zhì)部中表達(dá)量最高［6,15］。對(duì)3個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量量化（圖4），CSLD3在根中表達(dá)最高，KOR在莖中表達(dá)最高。以EF-1α和ACTIN-7內(nèi)參基因組合標(biāo)準(zhǔn)化，目的基因也顯示出一致的表達(dá)水平，進(jìn)一步表明了這3個(gè)內(nèi)參基因的可靠性。

3 討論

SPIEGELAERE等［16］研究認(rèn)為軟件間的算法和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同導(dǎo)致結(jié)果的差異，因此在評(píng)估內(nèi)參基因時(shí)應(yīng)先綜合分析各軟件的結(jié)果，再進(jìn)行比較排序，最終篩選出最適宜的內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種類(lèi)型的組織、細(xì)胞和各種實(shí)驗(yàn)因素條件下均恒定表達(dá)［17-18］。但大量實(shí)驗(yàn)表明：內(nèi)參基因只是在一定的范圍內(nèi)可以穩(wěn)定表達(dá)，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，應(yīng)該篩選特定的內(nèi)參基因來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［19］。因此，本研究選擇了景寧木蘭在熱脅迫下的根、莖、葉組織進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選研究。得到UBC，EF-1α和ACTIN-7為熱脅迫下不同組織的最佳內(nèi)參基因，這3個(gè)內(nèi)參基因均是傳統(tǒng)內(nèi)參基因，其中UBC基因是泛素蛋白翻譯后修飾的的基因，參與細(xì)胞多種調(diào)控過(guò)程，如細(xì)胞周期，細(xì)胞的增值與分化，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［20］，在桂花Osmanthus fragrans花芽的不同發(fā)展階段［21］、 桉樹(shù)Eucalyptus robusta不同組織［22］中均表達(dá)穩(wěn)定；ACTIN是細(xì)胞的骨架成分，幾乎在所有的真核細(xì)胞中均有表達(dá)［23］，在楊樹(shù)Populus tomentosa不同光周期和低溫條件下的莖尖、幼葉、成熟葉和樹(shù)皮組織中、油菜Brassica campestris的營(yíng)養(yǎng)組織中以及番茄Lycopersicon esculentum的葉子和根組織中也表現(xiàn)出最佳的穩(wěn)定性［24-26］。EF-1α是一種重要的多功能蛋白，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯控制、骨架組成等多種重要的細(xì)胞學(xué)過(guò)程［27］。ACTIN和EF-1α在毛果楊Populustrichocarpa不同組織為材料［11］和梧桐Firmiana platanifolia種子的不同發(fā)育階段［28］中均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。SILVEIRA等［29］在一種重要牧草珊狀臂形草Brachiaria brizantha的內(nèi)參基因篩選中同樣得到EF-1α穩(wěn)定性最佳的結(jié)果。

圖4 CSLD3和KOR在景寧木蘭不同組織中的表達(dá)分析Figure 4 Expression of CSLD3 and KOR in different tissues of Magnolia sinostellata

理想的內(nèi)參基因的表達(dá)水平應(yīng)是適中的，不宜過(guò)高，也不宜過(guò)低，Ct應(yīng)為15～30［30］。本研究中18SrRNA基因的Ct遠(yuǎn)低于15，表達(dá)豐度過(guò)高，影響其穩(wěn)定性，不適宜作為內(nèi)參基因。在光皮樺Betula luminifera的根、莖、葉和種子等不同組織中也出現(xiàn)了18S的Ct過(guò)低的情況［10］。在牡丹Paeonia suffruticosa不同組織不同花期［31］以及水稻Oryza sativa受到稻縱卷葉螟Chaphalocrocis medinalis蟲(chóng)害誘導(dǎo)后內(nèi)參基因研究［32］中也得到了相同結(jié)果。而周良云等［33］對(duì)黃花嵩Artemisia annua進(jìn)行不同濃度的鎘處理，最終選取了ACTIN-7，18S和PAL為內(nèi)參基因來(lái)校正目的基因的表達(dá)量；蘇曉娟等［11］也發(fā)現(xiàn)毛果楊在鋅脅迫下18SrRNA穩(wěn)定性較好，可用作內(nèi)參基因。進(jìn)一步表明了不同植物在不同條件下，內(nèi)參基因穩(wěn)定性差異較大。

研究中選擇2個(gè)或2個(gè)以上的基因可以有效增加結(jié)果的可靠度及精確度，以此來(lái)減弱單一內(nèi)參基因可能造成的結(jié)果偏差［17］。劉文哲等［10］在光皮樺中通過(guò)目的基因的表達(dá)分析驗(yàn)證內(nèi)參基因的可靠性，結(jié)果顯示了3個(gè)內(nèi)參基因及其組合對(duì)目的基因定量標(biāo)準(zhǔn)化差異較小。PARK等［34］在不同品種甘薯Dioscorea esculenta的非生物脅迫條件下，使用單個(gè)穩(wěn)定的內(nèi)參基因ARF和最佳內(nèi)參基因組合（ARF/COX）對(duì)2個(gè)目的基因IbLEA14和swpa2進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果也顯示了單個(gè)內(nèi)參基因和組合驗(yàn)證對(duì)目的基因表達(dá)水平的校準(zhǔn)結(jié)果基本一致。本研究以EF-1α和ACTIN-7為組合內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)單個(gè)內(nèi)參EF-1α與其有微小差異，2個(gè)基因組合可使基因定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。但是與單個(gè)基因做內(nèi)參相比，2個(gè)或2個(gè)以上的基因做內(nèi)參需要增加更多的樣本量和耗費(fèi)大量成本，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無(wú)明顯差異。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可綜合考慮后再進(jìn)行選擇。