鄢樹楓，黃曉晨，邢建宏，劉希華，張君誠

（1.三明學院 藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建 三明365004；2.三明學院 資源與化工學院，福建 三明 365004；3.中國科學院福建物質結構研究所，福建 福州 350002）

當前，癌癥仍然是廣泛威脅人類健康的重大疾病之一，每年都造成全世界大量的患者死亡。 針對癌癥治療，外科手術治療、放射療法和化學療法是目前臨床應用中傳統(tǒng)的三種方式。 光動力療法（Photodynamic Therapy，PDT）是一種新型的腫瘤治療方法，主要是利用光敏劑在有氧條件下被特殊波長的光激發(fā)后，產生具有細胞毒性的單線態(tài)氧。 相比于傳統(tǒng)的癌癥治療方式，光動力療法是一種微創(chuàng)、幾乎沒有副作用的新療法。 目前，光動力療法已經被證實可作為高效的抗腫瘤治療手段，在科研和臨床上都有較廣泛的探索和應用[1-2]。 光動力療法的療效主要依賴于光敏劑，不同的光敏劑具有的激發(fā)波長、單態(tài)氧產率和細胞毒性等各不相同。 迄今為止，只有少數幾種光敏劑得到官方批準上市應用[3-5]。 本文在前期化學合成ZnPc(TAP)4光敏劑的基礎上[6]，進一步研究ZnPc(TAP)4光敏劑的光化學性質、單線態(tài)氧產量以及對腫瘤細胞和正常細胞的選擇毒性，以期為光動力抗腫瘤治療提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗相關試劑主要購買于阿爾法化工有限公司、西格瑪奧德里公司和百靈威公司等。 人乳腺癌MCF-7 細胞和正常成纖維細胞HELF 由中國科學院福建物質結構研究所提供。DCFH-DA 單線態(tài)氧探針、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、胎牛血清、DMEM 細胞培養(yǎng)液等細胞相關試劑和耗材購買于上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ZnPc(TAP)4光敏劑的pH 靈敏性分析

ZnPc(TAP)4光敏劑中帶有12 個二甲氨甲基基團，對于溶液的pH 值較敏感。 根據磷酸鹽緩沖液配方表，配置不同pH 的磷酸鹽緩沖液，將ZnPc(TAP)4光敏劑溶解在相應的pH 緩沖液里，再分別用Synergy 4 TM 混合式多功能讀板機采集各個孔的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜， 其中熒光檢測選擇610 nm 波長激發(fā)，檢測ZnPc(TAP)4光敏劑在635～900 nm 波段的熒光圖譜。 用軟件繪制不同pH條件下的紫外吸收和熒光圖譜。

磷酸鹽緩沖液配方見表1。母液的配制：0.2 mol/L Na2HPO4： 稱取 71.6 g Na2HPO4-12H2O， 溶 于 1 000 mL 水 ；0.2 mol/L NaH2PO4： 稱 取 31.2 g NaH2PO4-2H2O，溶于 1 000 mL 水。

表1 磷酸鹽緩沖液配方表

1.2.2 不同pH 條件下ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產量

為測定ZnPc(TAP)4 光敏劑的單線態(tài)氧產量情況，選擇2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）為單線態(tài)氧檢測探針。 體系中有單線態(tài)氧產生時，DCFH-DA 可轉變?yōu)?DCF（2，7-二氯熒光素），DCF 經400 nm 波長光激發(fā)，在528 nm 波長處有特征熒光產生。 因而，檢測528 nm 波長特征熒光的強度可推算體系單線態(tài)氧產量。設定不同pH 條件下的光照組和空白對照組，體系中加入過量的DCFH-DA探針。 不同pH 條件的光照組每隔30 s 光照一次， 并且在光照后立即檢測于酶標儀中檢測熒光值?？瞻讓φ战M則只孵育DCFH-DA 探針，不加入ZnPc(TAP)4光敏劑。 連續(xù)檢測3 min 后，匯集數據，用軟件繪制不同pH 條件下ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產量曲線。

1.2.3 細胞的計數與觀察

取凍存于液氮中的人乳腺癌MCF-7 細胞和正常成纖維細胞HELF，復蘇后分別傳代培養(yǎng)，約2～3 代后的細胞在顯微鏡不同倍數下觀察細胞狀態(tài)。 貼壁細胞應鋪滿80%以上T-25 細胞培養(yǎng)瓶底部，可保證實驗所需細胞數目。觀察細胞狀態(tài)良好時進行細胞消化傳代。細胞傳代：使用一次性無菌吸管吸去培養(yǎng)瓶內原有的細胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞表面1～2 次，加入1 mL 預熱的胰蛋白酶溶液，37℃培養(yǎng)箱中靜置約1 分鐘。用一次性無菌吸管吸去細胞培養(yǎng)瓶內的胰蛋白酶溶液，加入10 mL 新鮮、37℃預熱的細胞培養(yǎng)基，使用5 mL 移液槍吹打均勻細胞，盡可能將T-25 細胞培養(yǎng)瓶底部細胞全部吹打下來。 吸取部分細胞培養(yǎng)液于離心管中用于細胞計數，另取5 mL 新鮮、37℃溫浴的細胞培養(yǎng)液于T-25 細胞培養(yǎng)瓶，均勻后分別于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.4 腫瘤細胞和正常細胞對ZnPc(TAP)4 光敏劑的藥物攝取分析

按上述方法，在生物顯微鏡低倍鏡觀察細胞狀態(tài)。根據細胞計數結果，加入適量新鮮、37 ℃預熱的細胞培養(yǎng)基稀釋細胞懸液至所需細胞實驗濃度（50 000 個/ mL），吹打均勻后將細胞均勻轉移至96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL 細胞懸液至終濃度為10 000 個細胞/孔，將細胞置于37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。設置人乳腺癌MCF-7 細胞和正常成纖維細胞HELF 的攝取實驗組，每組設置4 個復孔以減小實驗誤差。 給予細胞賦予相同的藥物濃度（2 μmol/L），在不同的時間點（0、6、12 和 24 h）檢測ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取量。 具體實驗步驟如下：到達檢測時間點后，將孔中培養(yǎng)基棄去，用無菌PBS 或無血清細胞培養(yǎng)基洗滌3 次，加入200 μL 裂解液（主要成分為0.1 M NaOH / l% SDS）裂解1 h，使體系形成均一溶液。 在酶標儀中測定細胞提取液的熒光信號，測定各實驗孔細胞的總蛋白量。 取實驗孔裂解液 20 μL 至 96 孔透明板，加入 200 μL BCA 工作液，室溫靜置 2 h，檢測 562 nm處紫外/可見吸收值。 根據牛血清白蛋白標準曲線，計算實驗孔細胞的總蛋白量。 用每毫克蛋白含有多少毫克的ZnPc(TAP)4光敏劑來表示細胞對藥物的攝取。1.2.5 ZnPc(TAP)4光敏劑的正常細胞和腫瘤細胞毒性分析

按前述方法，用生物顯微鏡低倍鏡觀察乳腺癌MCF-7 細胞和正常HELF 細胞狀態(tài)。 根據細胞計數結果，分別加入適量新鮮、37 ℃溫浴的細胞培養(yǎng)液稀釋細胞懸液至所需實驗細胞濃度（50 000 個/mL），吹打混勻后于細胞 96 孔板鋪板細胞，每孔加入 200 μL 細胞懸液（10 000 個/孔），于 37 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過夜。 配置不同濃度的ZnPc(TAP)4光敏劑溶液備用。 根據實驗方案，設置不同濃度的實驗組（0.5， 1， 2， 4， 8 μmol/L）。 洗去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度 ZnPc(TAP)4光敏劑的培養(yǎng)基，藥物孵育2 h。 光敏劑孵育后，吸去細胞96 孔板培養(yǎng)孔內原有的藥物培養(yǎng)液，加入200 μL 新鮮、37 ℃溫浴的細胞培養(yǎng)液清洗1 次，再 加入200 μL 新鮮、37 ℃溫浴的細胞培養(yǎng)液。 混勻后，使用680 nm、100 mW 光源對細胞培養(yǎng)板進行均勻光照1 min（光劑量2.5 J/cm2）。光照后將細胞培養(yǎng)板放置37 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過夜。 24 h 后，利用MTT 法檢測細胞存活率。 MTT 全稱為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料，MTT 比色法可以檢測細胞存活率。 活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以使外源性MTT 變成水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，通常已死亡的細胞不存在這種現象。 此后利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細胞甲瓚，用酶標儀在490 nm 波長處測定其光吸收值，計算出細胞的存活率、繪制細胞存活率曲線圖。

2 實驗結果

2.1 ZnPc(TAP)4光敏劑的pH靈敏性

酞菁類光敏劑在生物應用過程中，藥物的自發(fā)聚集情況是不可忽視的一方面。 光敏劑聚集容易降低其單線態(tài)氧產量，降低了光動力抗腫瘤的治療效果[7]。 ZnPc(TAP)4光敏劑帶有12 個二甲氨甲基基團，pH 值的改變會影響其在水中的聚集程度。 配置不同pH 的緩沖液，研究ZnPc(TAP)4光敏劑的pH 靈敏性，分析ZnPc(TAP)4光敏劑的聚集情況有助于探索ZnPc(TAP)4光敏劑的活性。 結果如圖1 所示，ZnPc(TAP)4光敏劑的紫外吸收最大峰位置隨緩沖液pH 值升高發(fā)生了移動，當pH 值為8.0 時，Zn-Pc(TAP)4光敏劑的最大吸收峰位于650 nm 左右，光敏劑處于聚集狀態(tài)；當pH 值降低至6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的最大吸收峰位轉移到690 nm 左右，光敏劑處于單體狀態(tài)。 證明ZnPc(TAP)4光敏劑具有靈敏的pH 響應性能。 同時，ZnPc(TAP)4光敏劑的熒光圖譜隨緩沖液pH 值的改變也發(fā)生了明顯變化：當pH 值為 8.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的特征熒光值較小；當pH 值降低至 6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的特征熒光值顯著升高，達到6 000 左右，是pH 8.0 狀態(tài)熒光值的30 倍。 此差異主要由于其的活性狀態(tài)不同：pH 值為 8.0 時 ZnPc(TAP)4光敏劑處于聚集狀態(tài)，pH 值為 6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑處于單體狀態(tài)。 進一步證明ZnPc(TAP)4光敏劑能夠在1 個pH 單位內快速轉變其活性，這一優(yōu)勢有利于提高藥物的生物利用度。 據文獻報道，人體內的正常生理環(huán)境或正常細胞的細胞外pH 約為7.4，而腫瘤細胞環(huán)境因其缺氧、產生大量的代謝物，導致周邊腫瘤微環(huán)境維持偏酸性[8]，因此，ZnPc(TAP)4光敏劑所具有的靈敏pH 響應、單體和聚集體快速轉換性能，有利于在抗腫瘤治療中提高藥物的利用度。 酞菁類光敏劑的熒光強度還與藥物的光敏活性有關，高強度的熒光有利于藥物對腫瘤進行光學成像，有助于腫瘤的診斷和治療[9-10]。

圖1 ZnPc(TAP)4 光敏劑的pH 靈敏性

2.2 ZnPc(TAP)4光敏劑在不同pH條件下的單線態(tài)氧產量

酞菁鋅光敏劑在特殊波長光照條件下能夠產生單線態(tài)氧，作用于周邊環(huán)境，從而產生細胞毒性。 因此，檢測ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產量具有重要意義。 實驗結果如圖2 所示。ZnPc(TAP)4光敏劑在不同pH 條件下均有單線態(tài)氧產生，且其單線態(tài)氧產量與pH 值的大小存在明顯的負相關。 在pH 6.0 時，ZnPc(TAP)4光敏劑的單線態(tài)氧產量約是pH 8.0時的5 倍，證明ZnPc(TAP)4光敏劑在偏酸性環(huán)境中有更高的單線態(tài)氧產量。 結合ZnPc(TAP)4光敏劑的紫外和熒光特性，單線態(tài)氧產量的差異主要與其在不同pH 值條件下單體-聚集體轉換性能有關。 pH 6.0 時ZnPc(TAP)4光敏劑處于單體狀態(tài)，能夠產生更多的單線態(tài)氧，這有助于提高ZnPc(TAP)4光敏劑的腫瘤細胞毒性。

圖2 ZnPc(TAP)4 光敏劑在不同pH 條件下的單線態(tài)氧產量

2.3 腫瘤細胞和正常細胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取分析

研究細胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取量有助于分析藥物的細胞毒性能力。 尤其是腫瘤細胞，其攝取ZnPc(TAP)4光敏劑的能力與腫瘤細胞毒性密切相關。 本實驗研究人乳腺癌MCF-7 細胞和正常成纖維細胞HELF 對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取能力。 實驗結果如圖3 所示。 正常細胞和腫瘤細胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的藥物攝取能力和藥物孵育時間呈現正相關性。 腫瘤細胞在前3 個小時快速ZnPc(TAP)4光敏劑，在12～24 h 區(qū)間仍然有顯著的藥物攝取。 相比于腫瘤細胞，正常細胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的攝取要相對緩和，在前12 h 逐步攝取藥物，并且在12 h 后趨于穩(wěn)定， 達到攝取平臺期。實驗結果可證明相同的藥物濃度和孵育時間情況下， 腫瘤細胞對ZnPc(TAP)4的攝取能力明顯大于正常細胞。 腫瘤細胞對ZnPc(TAP)4光敏劑的攝取量約是正常細胞的2～3 倍。 這可能是由于腫瘤細胞表面通常帶負電荷，ZnPc (TAP)4光敏劑能夠更好地吸附于腫瘤細胞并且被腫瘤細胞攝??；同時，在腫瘤微酸性環(huán)境中，ZnPc(TAP)4光敏劑呈現單體狀態(tài)，具有更好的藥物活性。

圖3 腫瘤細胞和正常細胞對ZnPc(TAP)4 光敏劑的藥物攝取情況

2.4 ZnPc(TAP)4光敏劑的腫瘤細胞和正常細胞毒性

對于光動力治療中使用的酞菁鋅光敏劑，最重要的評價指標就是藥物的細胞毒性[11-12]。 本文選取正常的成纖維細胞HELF 和乳腺癌細胞MCF-7 來研究ZnPc(TAP)4光敏劑的正常細胞和腫瘤細胞毒性。 成纖維細胞HELF 和乳腺癌MCF-7 細胞經過復蘇活化至達到實驗要求， 將細胞接種于實驗板上。設置不同的藥物濃度梯度 0.5，1，2，4，8 μmol/L，用 MTT 法檢測細胞存活率。 實驗結果如圖4 所示，ZnPc(TAP)4光敏劑在設定的濃度范圍內對乳腺癌細胞MCF-7 具有明顯的腫瘤細胞毒性，在8 μmol/L 時就能夠使95%的腫瘤細胞死亡；相比于腫瘤細胞，ZnPc(TAP)4 光敏劑對成纖維細胞HELF 的細胞毒性顯著降低。 當藥物濃度為2 μmol/L 時，ZnPc(TAP)4光敏劑對腫瘤細胞的毒性約是正常細胞的2～3 倍。這主要是由于腫瘤細胞在生長過程中產生的代謝物導致其處于微酸性環(huán)境， 而正常細胞的酸堿性相對平衡，處于偏中性的環(huán)境中。 ZnPc(TAP)4光敏劑在腫瘤細胞的微酸性環(huán)境中維持單體狀態(tài)，其最大紫外吸收峰位于690 nm 左右，能夠產生大量的單線態(tài)氧，實現了高效的腫瘤細胞毒性。而在正常細胞環(huán)境中，大部分ZnPc(TAP)4光敏劑最大紫外吸收峰處于650 nm 的聚集體狀態(tài)，導致較少的單線態(tài)氧產量，降低了其對正常細胞的毒性。 因此，ZnPc(TAP)4光敏劑所具有的高靈敏pH響應性能賦予其獨特的腫瘤細胞選擇毒性，具有高效“靶向”殺傷腫瘤細胞的作用。

圖4 ZnPc(TAP)4 光敏劑對細胞的毒性分析

3 結論

研究結果表明，ZnPc(TAP)4光敏劑具有靈敏的pH 響應性能，具有高效“靶向”殺傷腫瘤細胞的能力和較低的正常細胞毒性。 證明ZnPc(TAP)4光敏劑能夠在1 個pH 單位內快速轉變其活性，有利于提高藥物的生物利用度：藥物在生理條件（生理pH 約7.4）下具有較低的細胞毒性，保證藥物的穩(wěn)定性和體內安全運輸；當藥物到達腫瘤微酸性環(huán)境時（腫瘤微環(huán)境pH 約 6.5），能夠從聚集態(tài)轉變成更有活性的單體狀態(tài)，實現更好的腫瘤細胞毒性作用。 同時，ZnPc(TAP)4光敏劑在微酸性環(huán)境中，其熒光顯著增強，有助于對體內腫瘤進行光學成像和診斷。 目前國內外已報道的應用于臨床診斷的光敏劑藥物包括四環(huán)素、金絲桃素、血卟啉衍生物(HpD)、5-氨基酮戊酸(ALA)及其酯類衍生物氨基酮戊酸己酯( HAL) 等。其中5-氨基酮戊酸( ALA)/PpIX 熒光成像利用激光光敏技術可以看到發(fā)射紅色熒光的增生組織，可輔助病變定界、識別殘留病灶、提高照光成功率和減少復發(fā)[13]。雖然如此，目前絕大多數的光敏藥物在臨床治療和診斷過程中仍然面臨較大挑戰(zhàn)，本課題研究的ZnPc(TAP)4光敏劑在腫瘤治療和熒光診斷方面具有鮮明特點，對于更好地推進光敏劑的臨床應用具有一定的參考價值和前景。