趙娜，楊雪海，陳芳，郭萬正，李曉峰，魏金濤*，陳明新，周廣生，傅廷棟，譚志平

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；3.湖北省恩施州巴東縣信陵鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，湖北 恩施 444399)

近年來，中國草食動物養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，伴隨而來的是飼草需求持續(xù)增加，供給矛盾顯現(xiàn)，尤以冬春季節(jié)缺口更為明顯。油菜(Brassicacampestris)易越冬，種植成本低、生物產(chǎn)量大、蛋白和脂肪含量高[1]，中國南北地區(qū)都適宜種植，可以緩解冬春季節(jié)飼草不足的矛盾。近年來，飼用油菜相關(guān)研究逐漸得到重視，且已有數(shù)個飼用雙低油菜品種如華油雜62、飼油1號、飼油36號等[2-3]。楊雪海等[4]研究了不同生長階段的油菜飼用營養(yǎng)價值。劉彥培等[5]報道了結(jié)實期全株油菜及油菜秸稈的混合青貯技術(shù)，青貯方式能較好保存油菜及其秸稈，且增強其適口性。王亞犁[6-7]研究了飼用油菜復合青貯育肥秦川牛、灘羊等，動物體增重效果明顯。飼用油菜經(jīng)青貯后適口性更好，但其對反芻動物瘤胃發(fā)酵參數(shù)及菌群結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。青貯玉米是反芻動物養(yǎng)殖中常用的飼料原料，從品種培育、青貯技術(shù)、青貯品質(zhì)、微生物菌落等方面得到了廣泛研究[8-12]，其適口性較好，對羊有較好的飼養(yǎng)效果[13]。本試驗以青貯全株玉米(Zeamays)為對照，研究青貯飼用油菜對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)、瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響，為飼用油菜在肉羊生產(chǎn)中的應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯飼用油菜：品種為華油雜62，收割時期為結(jié)莢初期。青貯后外觀為青黃色，具有酸香氣味。風干樣中粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量分別為11.35%、47.11%和33.80%。

青貯全株玉米：品種為雅玉8號，收割時期為蠟熟期。青貯后外觀為青黃色，具有酸香氣味。風干樣中粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量分別為13.10%、58.62%和35.71%。

1.2 青貯方法

將收割后經(jīng)晾曬、粉碎、揉絲的飼用油菜或全株玉米分別用ZL 5552型青貯打捆包膜一體機進行打捆成圓柱形青貯捆，每捆50 kg左右，置于水泥地面遮雨棚下存放60 d后備用。

1.3 試驗動物與試驗飼糧

將3月齡左右、體重(14.83±0.32) kg、健康的宜昌白山羊24只(公母各半)，隨機分為2組，每組4個重復，每個重復3只羊。試驗組飼喂含有青貯飼用油菜的全混合飼糧，對照組飼喂含有青貯全株玉米的全混合飼糧(表1)，預試期7 d，正試期90 d。

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗于2016年9月至12月在湖北省宜昌市農(nóng)業(yè)科學研究院宜昌白山羊保種繁育場進行。試驗羊全舍飼飼養(yǎng)，佩戴耳號，預試前驅(qū)蟲、免疫。試驗期間自由采食，自由飲水。

1.5 試驗方法

1.5.1生產(chǎn)性能測定 每天準確稱量記錄各處理組的飼料投放量及剩余量。分別于試驗開始及結(jié)束當天晨飼前逐只稱量試驗羊空腹體重。計算干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)、平均日增重(average daily gain，ADG)、料重比(feed to gain ration)等指標。

1.5.2瘤胃內(nèi)容物的采集與處理 在正飼期最后一天，每組屠宰6只羊。試驗羊只屠宰后立即取出瘤胃，用無菌手術(shù)刀在瘤胃背部切開口，用已滅菌的50 mL離心管盛取瘤胃內(nèi)容物，用蓋子密封后投入液氮中凍存待測。

1.5.3測定方法 干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、鈣、總磷的測定均參照張麗英[14]的方法。采用苯酚-次氯酸鈉比色法[15-16]測定氨態(tài)氮含量；采用PHS-3D型pH計測定pH；參照Bradford[17]提出的考馬斯亮藍法測定菌體蛋白濃度。采用氣相色譜法測定揮發(fā)性脂肪酸濃度[18]。

表1 全混合飼糧組成Table 1 Composition and nutrient levels of total mixed rations

1預混料為每kg飼糧提供碳酸氫鈉30.0 g，鐵60.0 mg，銅22.8 mg，鋅50.0 mg，錳80.0 mg，碘15.3 mg，鈷12.4 mg。Premix provided the following per kg of the diet: NaHCO330.0 g, Fe (as ferrous sulfate) 60.0 mg, Cu (as copper sulfate) 22.8 mg, Zn (as zinc sulfate) 50.0 mg, Mn (as manganese sulfate) 80.0 mg, I (as potassium iodide) 15.3 mg, Co (as Cobalt chloride) 12.4 mg.2營養(yǎng)水平除消化能外均為實測值。Nutrient levels were measured values, except for digestive energy.

1.5.4微生物群落多樣性測序與功能分析 MetaVxTM文庫構(gòu)建和Illumina MiSeq測序：使用Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA) 檢測DNA樣品的濃度，使用MetaVxTM文庫構(gòu)建試劑盒(GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ, USA)構(gòu)建測序文庫。以30～50 ng DNA為模板，使用金唯智設(shè)計的一系列PCR引物擴增原核生物16S rDNA上包括V3，V4以及V5的3個高度可變區(qū)(如果有真核生物DNA污染，只擴增V3和V4區(qū))。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物擴增V3和V4區(qū)，采用包含“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”序列的上游引物和包含“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”序列的下游引物擴增V4和V5區(qū)。另外，通過PCR向16S rDNA的PCR產(chǎn)物末端加上帶有Index的接頭，以便進行NGS測序[19]。使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)檢測文庫質(zhì)量，并且通過Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)檢測文庫濃度。DNA文庫混合后，按Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA)儀器使用說明書進行2×300/250 bp雙端測序(paired-end, PE)，由MiSeq自帶的MiSeq Control Software (MCS)讀取序列信息。

數(shù)據(jù)分析：雙端測序得到的正反向reads首先進行兩兩組裝連接，過濾拼接結(jié)果中含有N的序列，保留序列長度大于200 bp的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)分析，使用VSEARCH(1.9.6)進行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%)。然后用RDP classifier (ribosomal database program)貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成[20]?；贠TU的分析結(jié)果，采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法，分別計算Shannon、Chao1等Alpha多樣性指數(shù)，并作出稀釋曲線。通過unweighted unifrac距離矩陣分析比較樣本間是否有顯著的微生物群落差異。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007處理后，數(shù)值用“平均值±標準差”表示，并用SPSS 18.0進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯飼用油菜對宜昌白山羊生產(chǎn)性能的影響

試驗組與對照組間山羊平均日增重、干物質(zhì)采食量及料重比無顯著差異(P>0.05)。飼喂青貯全株玉米和青貯飼用油菜對宜昌白山羊的生產(chǎn)性能影響差異不顯著(表2)。

2.2 青貯飼用油菜對宜昌白山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)和揮發(fā)性脂肪酸的影響

試驗組與對照組間山羊瘤胃液pH值、氨態(tài)氮無顯著差異(P>0.05)；試驗組山羊瘤胃液中菌體蛋白高于對照組(P<0.05) (表3)。試驗組山羊瘤胃液中異丁酸含量顯著高于對照組(P<0.05)，其他揮發(fā)性脂肪酸含量差異不顯著(P>0.05)。

2.3 青貯飼用油菜對白山羊瘤胃微生物多樣性的影響

2.3.1樣品序列測序深度和多樣性分析 基于相似度大于97%的原則，將獲得的有效序列進行聚類，共獲得1002個OTUs(圖1)。其中試驗組有973個OTUs，對照組有988個，兩組間共享的OTUs有959個。說明兩個試驗組菌群構(gòu)成同時具有特異性和相似性。經(jīng)計算，試驗組和對照組的序列覆蓋度(coverage)分別為89.36%和91.84%(表4)。

圖2 中樣品稀釋曲線中每條曲線代表一個樣本，用不同顏色標記；隨測序深度增加，OTUs的數(shù)量隨之增加。當曲線趨于平緩時表示隨著抽取的數(shù)據(jù)量的加大，檢測到的OTUs數(shù)目不再增加，此時的測序數(shù)據(jù)量較為合理。本試驗的測序深度下，檢測到的OTUs數(shù)目不再增加，可以覆蓋樣品中的大多數(shù)微生物。

表2 宜昌白山羊生產(chǎn)性能Table 2 Production performance of Yichang white goat

表3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定值Table 3 The value of rumen fermentation parameters

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: In the same row, values with different small letter mean significant difference (P<0.05), and no letters indicate that the difference is not significant(P>0.05). The same below.

Alpha多樣性指數(shù)主要用于評價樣品中微生物的豐富性和均勻性。由表5可以看出，在同一測序深度下，比較兩組的Alpha多樣性指數(shù)可知，ACE、Chao1、Shannon、Simpson等指數(shù)間差異均不顯著(P>0.05)。

2.3.2不同水平瘤胃微生物種群結(jié)構(gòu)分析 各樣本進行Illumina Miseq雙末端測序，所得有效序列在不同分類水平上進行物種注釋和統(tǒng)計，宜昌白山羊瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)包括19門、30綱、53科、113屬。試驗組和對照組樣本中的細菌多樣性差異不顯著。

從門水平瘤胃液細菌區(qū)系物種組成的相對豐度分析(表6)，相對豐度大于0.1%的菌門，試驗組有15個，對照組有14個，組間的差異不顯著(P>0.05)。兩組中共有的豐度較高的菌門依次是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetae)和Saccharibacteria。其他菌門如黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、裝甲菌門(Armatimonadetes)等雖也有檢出，但每個菌門的相對豐度均不足0.01%。

圖1 OTUs韋恩圖Fig.1 Venn graph of OTUs

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Sample dilution curve

組別 Groups有效序列數(shù)目 Nochimera有效序列平均長度Effective sequence average length (bp)有效數(shù)據(jù)的GC百分比含量GC percentage of valid data (%)有效序列數(shù)目與原始PE reads數(shù)目的百分比Ratio of nochimeras to original PE reads (%)對照組Control group221886.80±37162.40451.05±0.9053.85±0.2091.84±1.75試驗組Test group162632.00±25913.45451.57±0.7554.13±0.2889.36±3.81

表5 Alpha多樣性指數(shù)分析Table 5 Comparison of Alpha diversity indices of rumen microbial communities calculated

表6 瘤胃液中門水平微生物豐度Table 6 Phylum level significance analysis of rumen fluid microbes (%)

從屬水平瘤胃液細菌區(qū)系物種的相對豐度分析(表7)，相對豐度在0.01%以上的屬有85個。在屬的水平上，兩個處理組山羊瘤胃液中普雷沃氏菌屬(Prevotella)微生物含量均最多。屬水平上，普雷沃氏菌屬-1(Prevotella_1)、理研菌屬腸道組RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬(Saccharofermentans)、克里斯滕森菌科R-7(Christensenellaceae_R-7_group)、普雷沃氏菌屬UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)、普雷沃氏菌屬UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)和瘤胃球菌屬UCG-011(Ruminococcus_UCG-011)等均為宜昌白山羊瘤胃優(yōu)勢菌群。試驗組和對照組數(shù)量有顯著差異的菌群為普雷沃氏菌屬-1(Prevotella_1)(P<0.05)。不能歸類到目前已知菌屬的細菌相對豐度高達26.71%和22.91%。與對照組相比，青貯飼用油菜和青貯全株玉米對宜昌白山羊瘤胃中菌群的種類和豐度影響差異不顯著。

3 討論

3.1 青貯飼用油菜對宜昌白山羊瘤胃參數(shù)和揮發(fā)性脂肪酸的影響

日糧在瘤胃中發(fā)酵、有機酸的代謝情況可以用瘤胃液pH值反映。日糧對瘤胃液pH值影響較大，一般認為瘤胃液pH值的正常范圍為5.5～7.5[21]。本研究中各試驗組瘤胃液pH在6.7～6.8， 且組間差異不顯著，說明青貯飼用油菜和青貯全株玉米在瘤胃中的發(fā)酵、代謝均正常。

表7 瘤胃液中屬水平菌群分布Table 7 Level of bacterial flora abundance in rumen fluid (%)

山羊瘤胃中的氨態(tài)氮主要來源于食糜中的蛋白氮和非蛋白氮的降解，其濃度在一定程度上反映了日糧成分中的蛋白降解與合成間所達到的平衡狀況。Hume[22]的體內(nèi)試驗表明瘤胃中氨態(tài)氮最適濃度為9 mg·dL-1。也有研究表明微生物生長對氨氮濃度耐受的臨界范圍為6～30 mg·dL-1[23]。本試驗的兩個處理組的瘤胃氨態(tài)氮濃度均適宜瘤胃微生物生長。

微生物經(jīng)復雜發(fā)酵合成的瘤胃微生物蛋白質(zhì)，為反芻動物小腸提供大量的可吸收蛋白質(zhì)，為畜體提供所需要蛋白質(zhì)的40%～60%，是最主要的氮源供應者[24]。瘤胃內(nèi)碳水化合物和氮的利用效率決定了微生物蛋白質(zhì)的合成情況。本研究中試驗組宜昌白山羊瘤胃液菌體蛋白高于對照組，說明青貯飼用油菜的營養(yǎng)物質(zhì)更有利于瘤胃微生物蛋白質(zhì)的合成。

反芻動物主要的能量來源之一是揮發(fā)性脂肪酸，日糧組成影響瘤胃發(fā)酵合成揮發(fā)性脂肪酸的效率和濃度等。梁艾東[25]報道，全株青貯玉米對肉羊瘤胃pH、NH3-N濃度以及乙酸、丙酸、丁酸濃度均有不同程度的影響。但是張顯東[26]報道，全株玉米青貯對綿羊瘤胃液pH值變化有較大影響，對綿羊瘤胃的NH3-N濃度、揮發(fā)性脂肪酸濃度和瘤胃液稀釋率影響較小。曲永利等[27]發(fā)現(xiàn)飼喂不同收獲期玉米青貯日糧對奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境及發(fā)酵產(chǎn)物的影響不顯著。本研究中兩個處理組日糧經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵后的主要產(chǎn)物為乙酸，瘤胃發(fā)酵類型主要是乙酸型。異丁酸是異位酸之一，本研究中試驗組異丁酸含量顯著高于對照組，但是兩組間其他揮發(fā)性脂肪酸的含量均無顯著差異；試驗組山羊瘤胃中菌體蛋白含量也高于對照組，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于異丁酸可以緩解瘤胃蛋白質(zhì)降解速度，提高菌體蛋白質(zhì)濃度[28]。

3.2 青貯飼用油菜對白山羊瘤胃微生物多樣性的影響

瘤胃微生物多樣性受多方面的影響，其中日糧組成對瘤胃微生物有顯著的影響。反過來，瘤胃微生物也影響到宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫等[29]。高通量測序技術(shù)對不同日糧處理的反芻動物瘤胃內(nèi)容物樣品檢測后，采用可獲得大量微生物的生物學信息，便于更準確地分析日糧與瘤胃微生物的關(guān)系[30]，在研究日糧組成對反芻動物瘤胃微生物影響的相關(guān)方面效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

本研究經(jīng)Illumina Miseq雙末端測序得知，試驗組和對照組宜昌白山羊瘤胃細菌多樣性差異不顯著。兩組中共享的豐度較高的菌門依次是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetae)和Saccharibacteria。這與以往的研究結(jié)果相一致[31-32]，擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)在很多草食動物胃腸道微生物中均為優(yōu)勢菌門。瘤胃中非纖維性碳水化合物的主要降解者為擬桿菌門微生物，如普雷沃氏菌屬；而厚壁菌門含有大量分解纖維的菌屬，如瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬、假丁酸弧菌屬等。

在屬的水平上，本試驗兩個組的山羊瘤胃液中普雷沃氏菌屬(Prevotella)的豐度均最高，提示了此菌屬在瘤胃發(fā)酵中的重要性。宜昌白山羊瘤胃核心微生物組大部分為普氏菌。反芻動物瘤胃內(nèi)的普雷沃菌屬對多種營養(yǎng)物質(zhì)的降解都有著極其重要的作用[33]。Avgustin等[34]研究表明普雷沃菌屬雖然不能降解纖維素，但卻是瘤胃中主要的蛋白降解菌之一；普雷沃氏菌屬屬于耗氫菌，主要分解蛋白質(zhì)、淀粉。本研究結(jié)果，對照組山羊瘤胃中Prevotella_1數(shù)量高于試驗組，瘤胃液中菌體蛋白含量結(jié)果與之相反，可能是普雷沃菌屬中Prevotella_1降解了瘤胃中的菌體蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌屬、理研菌屬腸道組RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬(Saccharofermentanst)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、瘤胃球菌屬UCG-011(Ruminococcus_UCG-011)等為宜昌白山羊瘤胃優(yōu)勢菌群。瘤胃球菌屬(Ruminococcus)曾被認為是瘤胃中主要的纖維降解菌，該屬所含的白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌能分泌大量的纖維素酶和半纖維素酶[35-36]，其豐度的提高能顯著促進瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用。但已有大量研究表明，瘤胃球菌屬的相對豐度在瘤胃微生物中僅占很小的比例[37-38]，而本研究中試驗組和對照組山羊瘤胃中瘤胃球菌屬相對豐度分別達到4.5%和3.5%左右。瘤胃中的纖維降解菌除瘤胃球菌外，還有產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和梭菌等，但是本次檢測結(jié)果這幾種菌的豐度均不高。

Alpha多樣性指數(shù)中的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)反映樣品中物種群落的豐富度，Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)則反映物種的多樣性。本研究中在同一測序深度下，兩組的Chao1、Shannon、Simpson等指數(shù)間差異均不顯著，說明青貯飼用油菜和青貯全株玉米對瘤胃微生物的豐富度和多樣性影響無顯著差異。

日糧的營養(yǎng)成分顯著影響瘤胃微生物數(shù)量、揮發(fā)性脂肪酸含量等[39]，本研究中青貯飼用油菜與青貯全株玉米相比，對宜昌白山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)、瘤胃菌群結(jié)構(gòu)無不良影響。與青貯玉米相比，飼用油菜的適宜種植地域廣闊，生物產(chǎn)量更高，在草食動物的養(yǎng)殖上具有較好的應用前景。

4 結(jié)論

結(jié)合瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物菌群高通量測序結(jié)果，飼喂青貯飼用油菜能保持山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境及微生物菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，維持瘤胃正常發(fā)酵。