陳玉香，趙婷婷，姚 月，徐立新

蚯蚓黏液促進(jìn)玉米秸稈分解及其機(jī)理分析

陳玉香1，趙婷婷1，姚 月1，徐立新2

（1. 吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130022；2. 吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022）

為探究“蚓觸圈”黏液對(duì)還田后玉米秸稈分解的作用，將玉米秸稈與燒灼過(guò)的石英砂混合，模擬還田后玉米秸稈分解過(guò)程。分別向該混合物中添加赤子愛(ài)勝蚓黏液、葡萄糖和谷氨酸。黏液總糖質(zhì)量濃度為1.3 mg/mL,粗蛋白質(zhì)量濃度為3.4 mg/mL。整個(gè)試驗(yàn)期間，黏液組碳氮礦化速率始終高于對(duì)照組，表明蚯蚓黏液對(duì)碳氮礦化具有促進(jìn)作用，黏液的促進(jìn)作用出現(xiàn)時(shí)間遲于葡萄糖和谷氨酸。對(duì)于細(xì)菌群落，黏液組ACE、Chao和Shannon-Wiener指數(shù)分別為630.24、640.08和4.90，對(duì)照組相應(yīng)值分別為240.70、215.75和3.41。對(duì)于真菌群落，黏液組ACE、Chao和Shannon-Wiener指數(shù)分別為171.43、165.80和2.42，對(duì)照組相應(yīng)值分別為71.56、70.58和0.50。表明黏液組微生物豐度和多樣性均高于對(duì)照組。該研究結(jié)果表明，“蚓觸圈”黏液對(duì)還田后玉米秸稈分解起著重要作用。

秸稈；分解；蚯蚓黏液；微生物組成

0 引 言

全世界作物秸稈年產(chǎn)量達(dá)74×109t[1]，對(duì)如此大量的生物質(zhì)進(jìn)行恰當(dāng)管理是環(huán)境保護(hù)的基本要求。作物秸稈還田能夠提供可被植物利用的碳、氮和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，因此秸稈還田不僅是一種有益的農(nóng)業(yè)廢棄物管理方法，也是一種提高土壤肥力的可行策略[3]。此外，秸稈還田也使農(nóng)田土壤碳蓄積潛能增大[4]，同時(shí)還增加了表層土壤（0～20 cm）的有機(jī)碳儲(chǔ)存[5-6]。

蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)中有益土壤動(dòng)物之一，就生物量和活力而言，它也是土壤動(dòng)物中最重要的食碎屑者[7]。蚯蚓與其周?chē)h(huán)境構(gòu)成“蚓觸圈”[8]。據(jù)報(bào)道，一克生物量蚯蚓平均每天能產(chǎn)生5.6 mg黏液[9]。因此黏液是蚓觸圈的重要組成部分。許多研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓黏液加速了堆肥過(guò)程中有機(jī)物的分解[10]。還有研究證實(shí)，添加簡(jiǎn)單易被微生物利用的有機(jī)物可促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)礦化，釋放二氧化碳，從而產(chǎn)生激發(fā)效應(yīng)[11]。蚯蚓黏液是低分子量水溶性碳水化合物、氨基酸、糖苷和糖蛋白的混合物[12-13]，黏液可以作為微生物的易同化碳源[14]。蚯蚓的黏液促進(jìn)了新鮮植物殘余物的礦化[9]。表明蚯蚓黏液對(duì)激發(fā)效應(yīng)有一定的誘導(dǎo)作用，但是目前尚不清楚蚯蚓黏液如何影響還田后玉米秸稈的分解作用。

玉米秸稈是一種木質(zhì)纖維素類(lèi)作物殘余物，由復(fù)雜聚合物組成，難以被降解。本研究中將玉米秸稈與燒灼過(guò)的石英砂混合，以模擬玉米秸稈還田。由于微生物在分解有機(jī)物過(guò)程中起主要作用，因此本研究對(duì)底物中微生物群落的組成進(jìn)行了研究。纖維素酶與有機(jī)碳分解相關(guān)，蛋白酶和脲酶參與氮循環(huán)，脫氫酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)微生物種群代謝活力的指標(biāo)，且與氧化磷酸化過(guò)程有關(guān)[15]。本文研究了纖維素酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶活力隨時(shí)間變化情況。本研究旨在認(rèn)識(shí)蚯蚓黏液對(duì)玉米秸稈分解作用的影響；比較黏液和葡萄糖、谷氨酸對(duì)玉米秸稈分解作用的影響。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 黏液和玉米秸稈

本研究中使用的黏液收集于赤子愛(ài)勝蚓，并且選擇成蚓收集黏液。用蒸餾水沖洗蚯蚓至少4次。將蚯蚓放置于潮濕濾紙上，6 ℃暗環(huán)境中3 d以排除腸內(nèi)容物。隨后用無(wú)菌水沖洗蚯蚓，將其置于盛有20 mL無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，每皿放入3條蚯蚓，6 ℃暗環(huán)境中24 h，用20個(gè)培養(yǎng)皿收集黏液[9]。黏液用無(wú)菌水稀釋10倍。風(fēng)干玉米秸稈粉碎過(guò)0.25 mm篩。秸稈的C:N為75.45。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將玉米秸稈粉與預(yù)先700 ℃燒灼過(guò)的石英砂（1:10）充分混合，混合物總有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.04 g/kg，pH值7.5。在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，添加上述方法所獲取的蚯蚓黏液。每495 g混合底物添加20 mL黏液。為對(duì)比黏液與葡萄糖、谷氨酸的作用，也設(shè)置了葡萄糖、谷氨酸試驗(yàn)組，其中葡萄糖、谷氨酸溶液濃度與上述蚯蚓黏液中的總碳水化物含量或粗蛋白含量相當(dāng)。本研究有4種處理方法：對(duì)照組CK（495 g混合底物+20 mL無(wú)菌水），Glc（495 g混合底物+20 mL 0.13 mg/mL葡萄糖溶液），Glu（495 g混合底物+20 mL 0.34 mg/mL谷氨酸溶液）和Muc（495 g混合底物+20 mL稀釋后的黏液）。試驗(yàn)在塑料花盆中進(jìn)行，每種處理方法有18盆，這是為了滿足6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，每次取樣在3盆中進(jìn)行，也就是每次取樣用掉3盆。試驗(yàn)進(jìn)行期間，通過(guò)噴灑滅菌水，使底物含水率維持在55%～65%左右。分別于第0、10、20、30、40、50天取樣進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 黏液主要化學(xué)成分分析

蚯蚓黏液是低分子量水溶性碳水化合物、氨基酸、糖苷和糖蛋白的混合物[12-13]。采用硫酸-苯酚法測(cè)定黏液總糖含量[16]。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定黏液總蛋白質(zhì)含量[17]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測(cè)定了黏液蛋白質(zhì)分子質(zhì)量[18]。

1.4 有機(jī)碳氮礦化速率

采用重鉻酸鉀和濃硫酸氧化法測(cè)定總有機(jī)碳含量（total organic carbon）[19]。有機(jī)碳礦化速率（min）計(jì)算如公式（1）。

式中TOC指第天時(shí)有機(jī)碳含量，mg/kg；TOC+10指(+10)d時(shí)有機(jī)碳含量，mg/kg。

礦質(zhì)氮含量是銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量之和，采用文獻(xiàn)[20]方法測(cè)定銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。氮的凈礦化速率（min）計(jì)算如公式（2）

式中N指第天時(shí)的礦質(zhì)氮含量，mg/kg；N+10指 (+10) d時(shí)礦質(zhì)氮含量，mg/kg。計(jì)算6個(gè)采樣日期（即第0、10、20、30、40、50天）之間S1（第0～10天）、S2（第10～20天）、S3（第20～30天）、S4（第30～40天）和S5（第40～50天）的碳和氮礦化速率， mg/（kg?d）。

1.5 酶活力測(cè)定

羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測(cè)定方法參考Chen等[21]。蛋白酶活力通過(guò)測(cè)定氨基酸釋放量來(lái)測(cè)定，將1.0 g樣品（鮮質(zhì)量）與2%酪蛋白酸鈉在50 ℃下保溫2 h，隨后在0.5 mL提取液中加入福林酚試劑，用BioTek酶標(biāo)儀在700 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度[22]。蛋白酶活力是指每小時(shí)釋放1mol酪氨酸所需的酶量。脲酶活力測(cè)定方法如下：1 g新鮮樣品(1%)與尿素（1%）在38 ℃下保溫3 h后，測(cè)定水解所釋放的NH4+來(lái)確定酶活力[23]。脲酶活力是指每小時(shí)從尿素中釋放1g NH4+所需酶量。脫氫酶活力測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法，在30 ℃下保溫24 h，通過(guò)TTC到三苯基甲酰胺（TPF）的還原速率來(lái)計(jì)算脫氫酶活力，在545 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度[24]。脫氫酶活力指每小時(shí)從1g TTC減少到TPF的所需酶量。

1.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

微生物群落結(jié)構(gòu)分析使用E.Z.N.A.DNA提取試劑盒(OmegaBiotek，USA)。根據(jù)操作指南提取DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳確定其純度。根據(jù)Chen等方法[21]，擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因V3-V4序列和真菌18SrRNA基因ITS序列，PCR產(chǎn)物使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（Axygen）純化，純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，委托中國(guó)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)[25]在97%相似水平將序列聚類(lèi)成為操作分類(lèi)單元（OTUs），計(jì)算豐度和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用兩因素方差分析確定取樣時(shí)間和不同處理（CK、Glu、Glc、Muc）對(duì)有機(jī)碳、氮礦化及酶活力的影響。在同一取樣時(shí)間，用單因素方差分析不同處理對(duì)有機(jī)碳氮礦化和酶活力的影響。所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示。當(dāng)<0.05時(shí)，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 黏液主要化學(xué)成分分析

硫酸-苯酚法測(cè)得黏液中總糖質(zhì)量濃度為1.3 mg/mL，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得黏液的粗蛋白質(zhì)量濃度為3.4 mg/mL。

用丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法得到赤子愛(ài)勝蚓黏液中蛋白質(zhì)電泳圖（圖1），從圖中可以看出，蚯蚓黏液中蛋白質(zhì)的明顯條帶出現(xiàn)在44.3和22.1 kDa附近，此外，在44.3～97.2 kDa之間和22.1 kDa附近也存在條帶。由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得到黏液中蛋白質(zhì)明顯條帶的分子質(zhì)量為44.6和21.5 kDa。我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ髦幸卜治隽损ひ旱鞍踪|(zhì)的氨基酸組成，赤子愛(ài)勝蚓黏液的蛋白質(zhì)由16種氨基酸構(gòu)成，其中組氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量相對(duì)較高[26]。

注：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 2.黏液

蚯蚓黏液中富含的糖、氨基酸為微生物生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而增加了微生物的種類(lèi)和數(shù)量，這與趙海濤等[27]的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，環(huán)境中游離的氨基酸可以透過(guò)微生物的生物膜，直接被微生物利用合成目標(biāo)蛋白或者為微生物的生長(zhǎng)代謝提供氮源[28]。黏液中的糖類(lèi)和氨基酸等物質(zhì)促進(jìn)了微生物的繁殖和代謝，從而提高了微生物產(chǎn)物即纖維素酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶的活性，最終加快了碳氮礦化速率，加快了秸稈的堆制進(jìn)程。

2.2 添加物對(duì)碳、氮礦化的影響

處理方式明顯影響碳礦化速率，并且其影響與取樣時(shí)間有關(guān)。此外，取樣時(shí)間與處理組之間存在顯著交互作用（圖2、表1）。在試驗(yàn)過(guò)程中，碳礦化速率呈現(xiàn)波動(dòng)變化。在第10天時(shí)，Muc組碳礦化速率為0.83 mg/(kg?d)，而CK組、Glc組和Glu組分別為0.60、0.82和0.99 mg/(kg?d)。表明，在第10天，添加黏液、葡萄糖、谷氨酸明顯增加了碳礦化速率（單因素方差分析，=22.008，<0.00l）。在初期，添加黏液、葡萄糖和谷氨酸促進(jìn)了碳礦化，而且黏液和谷氨酸的作用強(qiáng)于葡萄糖。在第20天時(shí)，所有處理組的碳礦化速率都極低。這與Kuzyakov and Bol[29]研究結(jié)果相似，他們認(rèn)為，碳是依據(jù)可被利用的難易程度依次利用。蚯蚓黏液是低分子量水溶性碳水化合物、氨基酸、糖苷和糖蛋白的混合物[12-13]。本研究所添加的糖、氨基酸和黏液很容易被微生物群利用，這些物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)迅速被微生物同化。Kuzyakov and Bol[29]還發(fā)現(xiàn)，在微生物集中利用活性碳源期間，惰性碳（本研究中的秸稈）分解明顯減慢。

表1 取樣時(shí)間與處理方式對(duì)碳氮礦化影響的統(tǒng)計(jì)分析

這就可以解釋為什么在第20天時(shí)碳礦化速率極其低。第30天時(shí)，Muc組碳礦化速率明顯高于Glc組、Glu組和CK組（單因素方差分析，=3.319E3，<0.001），其值為1.16 mg/(kg?d)。在第40天時(shí)，Glc組、Glu組和CK組的碳礦化速率比第30 天有所增加，然而Muc組的卻在下降，這可能是由Muc組秸稈先于其他組達(dá)到降解穩(wěn)定。糖和氨基酸等低分子量物質(zhì)會(huì)迅速被微生物分解利用[30]，微生物對(duì)添加這些物質(zhì)迅速作出響應(yīng)，引發(fā)有機(jī)質(zhì)分解的激發(fā)效應(yīng)[31]。Kuzyakov and Bol認(rèn)為，激發(fā)效應(yīng)涉及一系列作用機(jī)理[29]：優(yōu)先利用易被利用的底物，激活相關(guān)微生物，然后根據(jù)底物可被利用難易程度依次利用，最后回歸到初始狀態(tài)，本研究中的碳礦化狀況與此一致。Glc組和Glu組的碳礦化速率在第10天出現(xiàn)最大值。添加黏液、葡萄糖和谷氨酸對(duì)底物的碳礦化均有促進(jìn)作用。與添加葡萄糖和谷氨酸對(duì)比，黏液的促進(jìn)作用出現(xiàn)稍遲一些，這與Bityutskii等的結(jié)果是一致的[9]。葡萄糖和谷氨酸比黏液更容易被微生物利用，因此，更早出現(xiàn)激發(fā)效應(yīng)。Muc組的碳礦化速率始終高于CK組，尤其是在第30天。因此，我們分析了第30天的Muc組和CK組樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)。

注：CK：對(duì)照組；Glc：葡萄糖處理組；Glu：谷氨酸處理組；Muc：黏液處理組；S1：第0~10天；S2：第10~20天；S3：第20~30天；S4：第30~40天；S5：第40~50天。下同。

處理方式對(duì)氮礦化有顯著影響，并且其影響作用與取樣時(shí)間相關(guān)。此外，取樣時(shí)間與處理方式之間存在顯著的交互作用（圖3、表1）。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，氮礦化速率呈現(xiàn)波動(dòng)變化。在第10天時(shí)，Muc組的氮礦化速率最高（單因素方差分析，=177.348，<0.001），而CK組的氮礦化率最低，表明添加黏液、葡萄糖和谷氨酸在此階段對(duì)氮礦化有促進(jìn)作用，并且黏液的促進(jìn)作用最為明顯。在第20天時(shí)，所有處理組均出現(xiàn)負(fù)礦化速率。然而在第30天時(shí)，僅有Muc組呈現(xiàn)負(fù)礦化速率。在第40天，Glc組和Muc組呈現(xiàn)正礦化速率，而CK組和Glu組呈現(xiàn)負(fù)氮礦化速率。在第50天時(shí)，僅Glc組呈現(xiàn)負(fù)礦化率。試驗(yàn)初期，全部處理組出現(xiàn)正氮礦化速率，表明底物中的有機(jī)氮被微生物分解，并且黏液對(duì)分解作用的影響最大。第20天時(shí)，處理組均出現(xiàn)負(fù)氮礦化速率。這是由于添加易于利用的物質(zhì)，如糖、氨基酸或黏液能夠激活微生物[29]。礦化速率為負(fù)值，表明微生物作用總的結(jié)果是固氮作用。在此階段，Muc組和Glc組對(duì)氮礦化的影響較強(qiáng)（單因素方差分析，=122.011，<0.00l）。

圖3 玉米秸稈的氮礦化

2.3 添加黏液、葡萄糖及谷氨酸對(duì)關(guān)鍵酶活力影響

2.3.1 羧甲基纖維素酶

不同處理組間CMCase酶活力有顯著差異，同一處理組不同時(shí)間CMCase酶活力也有顯著差異。此外，取樣時(shí)間與處理組之間存在交互作用（表2）。初期Muc組、Glu組和CK組中的CMCase的酶活力增加，在第30天到達(dá)峰值（圖4a），隨后CMCase酶活力開(kāi)始下降。Glc組中，CMCase活力的變化表現(xiàn)為雙峰型。第1個(gè)峰值在第10天前后出現(xiàn)，第2個(gè)峰值是在第30天左右。Muc組CMCase酶活力的波動(dòng)與碳礦化速率相一致。第10天時(shí)，Muc組羧甲基纖維素酶活力是CK組的4倍。添加黏液和谷氨酸組，CMCase活力明顯提高，進(jìn)而加快纖維素降解。

表2 取樣時(shí)間與處理方式對(duì)酶活力影響的統(tǒng)計(jì)分析

圖4 玉米秸稈分解過(guò)程中羧甲基纖維素酶、蛋白酶、脲酶、脫氫酶活力

2.3.2 蛋白酶

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，Muc組、Glu組蛋白酶活力均高于CK組和Glc組（圖4b）。蛋白酶活力顯著受處理方式影響且與時(shí)間相關(guān)。此外取樣時(shí)間與處理組之間存在顯著的交互作用（表2）。蛋白酶活力從第0天至30天呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在第10天時(shí)，Muc組、Glu組、Glc組和CK組的蛋白酶活力分別為6.45、5.93、4.79和5.12g/(g?h)。4個(gè)處理組（單因素方差分析，=324.626，<0.001）間存在顯著差異。蛋白酶催化含氮化合物的解聚，釋放可溶性有機(jī)氮，被認(rèn)為是氮循環(huán)的關(guān)鍵步驟，因?yàn)槲⑸餆o(wú)法利用氮的聚合物[32]。在第10天時(shí)，Muc組蛋白酶活力最高，表明該組氮礦化速率最高。從第10天到30天，Muc組和Glu組的蛋白酶活力快速上升，而Glc組和CK組蛋白酶活力則緩慢增加。從第30天開(kāi)始，蛋白酶活力開(kāi)始下降。初期蛋白酶活力較高，與Jurado等[33]的報(bào)道結(jié)果一致，他們認(rèn)為分解蛋白質(zhì)微生物通常在有機(jī)物分解的初始階段較為活躍。

2.3.3 脲酶

脲酶活力呈現(xiàn)雙峰，第1個(gè)峰值出現(xiàn)在第10天，第2個(gè)峰值出現(xiàn)在第40天（圖4c）。脲酶活力顯著受處理方式影響且與時(shí)間相關(guān)，此外時(shí)間與處理方式之間存在顯著的交互作用（表2）。在第10天時(shí)，Muc組、Glu組、Glc組和CK組的脲酶活力分別為4.84、4.36、3.36和3.25g/(g?h)。Muc組脲酶活力是CK組的1.5倍。此時(shí)Muc組高氮礦化速率與高脲酶活力相關(guān)聯(lián)。脲酶催化底物中的尿素轉(zhuǎn)化為二氧化碳和氨[15]。脲酶活力從第10天開(kāi)始下降，與第20天前后的負(fù)氮礦化速率相一致。從第30天至第40天，脲酶活力增加，這與Muc組和Glc組氮礦化速率的增加相吻合。

2.3.4 脫氫酶

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，Muc組、Glu組、Glc組脫氫酶活力明顯高于對(duì)照組（圖4d）。脫氫酶活力受到處理方式的顯著影響，且與時(shí)間相關(guān)，時(shí)間與處理方式之間存在顯著的交互作用（表2）。Muc組和Glu組脫氫酶活力在第0～20 天呈上升趨勢(shì)，隨后開(kāi)始下降。Muc組脫氫酶活力峰值為19.71g/(g?h)，而Glu組為15.99g/(g?h)。Glc組脫氫酶活力從第0天開(kāi)始升高，至第30天開(kāi)始下降，其峰值為14.96g/(g?h)。CK組脫氫酶活力在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)最高，為8.48g/(g?h)。脫氫酶活力表征土壤生態(tài)系統(tǒng)或其他生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中微生物活力[34]，脫氫酶酶活力較高，說(shuō)明活力微生物活性較強(qiáng)。脫氫酶活力隨時(shí)間變化反映了試驗(yàn)過(guò)程中微生物活性的變化。Muc組、Glu組和Glc組中，脫氫酶活力在初始階段呈上升趨勢(shì)，直至達(dá)到峰值之后下降。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)底物脫氫酶活力較低，表明底物趨于穩(wěn)定。試驗(yàn)后期脫氫酶活力下降與蛋白酶活力的下降是一致的。

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)

2.4.1 微生物多樣性分析

對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析，去除低質(zhì)量序列后，Muc組細(xì)菌序列21 762個(gè)，真菌序列27 313個(gè)，平均讀取長(zhǎng)度分別為435.96和260.47 bp，CK組細(xì)菌序列18 141個(gè)，真菌序列26 610個(gè)，平均讀取長(zhǎng)度分別為435.45和230.29 bp。

設(shè)置97%相似度水平下，Muc組和CK組的細(xì)菌OTU數(shù)量分別為566和167（表3），真菌OUT數(shù)量分別為在152和63。豐度和多樣性指數(shù)與此呈現(xiàn)一致趨勢(shì)（表3）。對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，Muc組的ACE和Chao的平均值分別為630.24和640.08，而CK組的相應(yīng)值分別為240.70和215.75，Muc組細(xì)菌群落的ACE和Chao的平均值分別是CK組2.6和3倍。Muc組Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為4.90，而CK組為3.41，Muc組細(xì)菌群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別是CK組的1.4倍，表明Muc組細(xì)菌豐度和多樣性均高于對(duì)照組。對(duì)于真菌群落，Muc組的ACE和Chao的平均值分別為171.43和165.80，而CK組的相應(yīng)值分別為71.56和70.58，Muc組真菌群落的ACE和Chao的平均值分別是CK組的2.4倍和2.3倍。Muc組Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為2.42，而CK組為0.50，Muc組真菌群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)分別是CK組的4.8倍，也就是說(shuō)Muc組的真菌的豐富度和多樣性也較高。結(jié)果表明，黏液對(duì)微生物群落的豐度和多樣性有顯著促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)轵球攫ひ汉腥菀妆晃⑸镂绽玫牡头肿恿刻妓衔?、氨基酸、糖苷和糖蛋白等物質(zhì)[12-14]。

表3 16S rRNA和18S rRNA基因文庫(kù)的OTUs豐度和多樣性指數(shù)的比較

2.4.2 微生物群落組成分析

Muc組中，細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬為Candidate_ division_TM7_norank、Phyllobacteriaceae_unclassified、、和（圖5a），其相對(duì)豐度分別為6.74%、6.43%、5.01%、4.95%和4.75%。還有和，相對(duì)豐度分別為3.5%和2.5%。CK組中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為、、Candidate_division_TM7_norank、_ unclassified、、根瘤菌和，其相對(duì)豐度分別為23.09%、10.00%、8.79%、7.38%、5.75%、5.32%和5.10%。在分類(lèi)學(xué)上未確定或相對(duì)豐度低于0.5的序列被指定為“其他”序列。屬的一些微生物是纖維素分解菌[35]，該屬的某些物種可有效分解結(jié)晶纖維素，并可利用結(jié)晶纖維素作為其唯一的碳和能量來(lái)源[36]。是典型的分解纖維素微生物[37]。的某些微生物在碳氮礦化過(guò)程中起著重要的作用。例如，KCTC 22041T具有還原硝酸鹽的能力，并能利用纖維二糖作為碳源[38]。部分屬促進(jìn)硝酸鹽還原，且影響脲酶活力[39]。

圖5 兩種處理組中細(xì)菌屬和真菌屬的比較

與對(duì)照組相比，Muc組的分解纖維素微生物及催化氮礦化微生物的相對(duì)豐度較高。Muc組中，真菌的優(yōu)勢(shì)菌為Incertae_unclassified、、Sordariomycetes_ unclassified、Fungi_unclassified和（圖5b），相對(duì)豐度為31.85%、22.66%、17.70%、16.37%和8.89%。對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)真菌為、、_unclassified和Incertae_unclassified，其相對(duì)豐度分別為90.57%、3.52%、3.24%、1.01%。特別值得注意的是，與CK組對(duì)比，Muc組鐮刀菌屬的相對(duì)豐度顯著增加。據(jù)報(bào)道[40]，該屬的某些微生物具有分解木質(zhì)纖維素能力。例如，產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶[40]，參與有機(jī)碳循環(huán)。具備將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為N2O的能力[41-42]。屬在木質(zhì)纖維素物質(zhì)分解和碳氮循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，該菌是添加黏液處理組的優(yōu)勢(shì)微生物。

3 結(jié) 論

1）與對(duì)照組對(duì)比，添加赤子愛(ài)勝蚓黏液，對(duì)玉米秸稈分解過(guò)程中的碳、氮礦化有促進(jìn)作用。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，Muc組的碳礦化速率始終高于CK組。第10天時(shí)，Muc組的氮礦化速率最高。

2）與葡萄糖組和谷氨酸組比較，黏液的促進(jìn)作用出現(xiàn)時(shí)間較遲。試驗(yàn)中，Glc組和Glu組的碳礦化速率均在第0～10 天有最大值，而Muc組在第20～30天有最大值；Glc組、Glu組的最大氮礦化速率均在第20～30天，而Muc組在第30～40天。

3）添加黏液可以提高纖維素酶、蛋白酶、脲酶和脫氫酶活力。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，Muc組蛋白酶、脫氫酶活力均高于CK組。第10天時(shí)，Muc組羧甲基纖維素酶、脲酶活力分別是CK組的4倍和1.5倍。

4）蚯蚓黏液中富含的糖、氨基酸為微生物生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而增加了微生物的種類(lèi)和數(shù)量。黏液處理組的微生物豐度和多樣性均高于對(duì)照組。Muc組細(xì)菌群落的ACE和Chao的平均值分別是CK組2.6和3倍；Muc組真菌群落的ACE和Chao的平均值分別是CK組的2.4倍和2.3倍。此外，Muc組細(xì)菌和真菌群落Shannon- Wiener多樣性指數(shù)分別是CK組的1.4倍和4.8倍。

5）黏液處理組的優(yōu)勢(shì)微生物為降解木質(zhì)纖維素微生物，其中部分微生物參與氮循環(huán)。Muc組相對(duì)豐度是CK組的2.5倍。其中，該屬的某些微生物具有分解木質(zhì)纖維素能力。研究結(jié)果表明，“蚓觸圈”的黏液對(duì)還田后的玉米秸稈分解起著重要的作用。

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Earthworm mucus improvingdecomposition of maize stover and its mechanism

Chen Yuxiang1, Zhao Tingting1, Yao Yue1, Xu Lixin2

(1.130022,; 2.130022)

Returning crop residues to soil is regarded as a beneficial agricultural management practice. The decomposition of the returned organic residues is a research concern, and the soil fauna plays an important role during the degradation process. Earthworms are generally regarded as a major and beneficial component of soil fauna. In the present study, the decomposition process was simulated by mixing the maize stover with the ignited quartz sand. The mucus of the earthwormwhich was an important component of drilosphere, glucose or glutamate were added to the mixture. Besides, glucose and glutamate were easily utilizable substrate for the microorganism. The total carbohydrate and crude protein contents in the mucus were analyzed. The total carbohydrate content was 1.3 mg/mL, and the crude protein content was 3.4 mg/mL. SDS-PAGE showed that the protein in the mucus was mainly comprised of two specific protein molecules with molecular weight approximately 44.6 and 21.5 kDa. The carbon and nitrogen mineralization, enzyme activity and microbial community structure were investigated in detail. In the experiment, the carbon mineralization rates of Glc and Glu groups reached a peak value at around 10th day, while that of Muc group reached a maximum value at 20th-30thday. The maximum nitrogen mineralization rates in both Glc and Glu groups were in the 20th-30thday, while those in Muc group were in the 30th-40thday. The effect of the mucus was compared with that of glucose and glutamate. During the whole experiment process, the carbon mineralization rate of Muc group was always higher than that of the control group. After comparing with the control group, it could be observed that the mucus had stimulatory effect on carbon and nitrogen mineralization. The delay effect of the mucus was observed when it was compared to glucose and glutamate. The activities of protease and dehydrogenase in Muc group were higher than those in CK group. On the 10thday, the activities of carboxymethyl cellulase and urease in Muc group were 4 times and 1.5 times of those in CK group, respectively. The average values of ACE and chao for bacterial community in Muc group were 2.6 and 3 times of those in CK group, respectively. The values of ACE and chao for fungal community in Muc group were 2.4 times and 2.3 times of those in CK group, respectively. In addition, the Shannon-wiener diversity index of bacterial and fungal communities in Muc group was 1.4 times and 4.8 times of that in CK group, respectively. The relative abundance ofin Muc group was 2.5 times of that in CK group. The activity of cellulolytic enzyme, protease, urease and dehydrogenase was increased by the addition of the mucus. The microbial abundance and diversity in the group treated with the mucus was higher than that in the control group. The predominant microbial genera in the group treated with the mucus were lingocellulolytic microorganism and some were involved in nitrogen cycle. This indicated that the mucus of drilosphere played an important role in decomposition of crop residues after being returned to soil.

straw; decomposition;earthworm mucus; microbial composition

10.11975/j.issn.1002-6819.2019.15.029

X71; S141

A

1002-6819(2019)-15-0234-07

2019-03-24

2019-07-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31872178）

陳玉香，博士，教授。從事生物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究。Email: chen@jlu.edu.cn

陳玉香，趙婷婷，姚 月，徐立新. 蚯蚓黏液促進(jìn)玉米秸稈分解及其機(jī)理分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2019，35(15)：234－240. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.15.029 http://www.tcsae.org

Chen Yuxiang, Zhao Tingting, Yao Yue, Xu Lixin. Earthworm mucus improving decomposition of maize stover and its mechanism[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(15): 234－240. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2019.15.029 http://www.tcsae.org