李加友，陳濤

(1.嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001；2.宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇 宿遷 223800)

氨基甲酸乙酯(EC)被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為2 A級(jí)致癌物，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織建議成年人每天的EC總攝入量不超過15 ng·kg-1(以體重計(jì))。黃酒中的EC是發(fā)酵過程中酵母及其他微生物代謝產(chǎn)生的。尿素、精氨酸、氰化物等都可以代謝形成EC的前體物質(zhì)，如氨甲酰磷酸、瓜氨酸等[1-2]。精氨酸是黃酒中EC形成的主要原因之一。精氨酸可以經(jīng)脫亞胺途徑產(chǎn)生瓜氨酸和氨甲酰磷酸，從而導(dǎo)致氨基甲酸乙酯的形成[3]；因此，研究黃酒生產(chǎn)過程中精氨酸脫亞胺酶的變化情況，掌握形成EC的前體物變化規(guī)律，對(duì)建立控制黃酒產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯含量的新工藝具有重要參考價(jià)值。為此，特開展試驗(yàn)研究，并總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

糯米，市售；麥曲，購(gòu)自江蘇微康生物科技有限公司；酒曲和黃酒酵母，購(gòu)自湖北安琪酵母股份有限公司；檸檬酸(分析純)、L-精氨酸(分析純)、L-瓜氨酸(分析純)，均購(gòu)自上海生工股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酒釀造

取500 g糯米浸泡48 h，蒸飯前瀝干，蒸汽穿透25 min。用攤飯法冷卻米飯溫度至28 ℃，將其加入發(fā)酵缸中，然后加入25 g麥曲、5 g黃酒酵母(加入前按照使用說明進(jìn)行活化)、1 L溫開水(40 ℃)，攪拌，使發(fā)酵劑和米飯均勻分布。將發(fā)酵缸置于25 ℃培養(yǎng)箱，5 d后將培養(yǎng)溫度調(diào)整為18 ℃，并用檸檬酸調(diào)節(jié)體系的pH至3.5。發(fā)酵過程中每隔2 d定期取樣檢測(cè)醪液中的精氨酸和瓜氨酸含量。以上工藝均按照無(wú)菌操作要求，嚴(yán)格控制環(huán)境中雜菌進(jìn)入發(fā)酵體系，保持發(fā)酵體系的生物穩(wěn)定性。

1.2.2 精氨酸脫亞胺酶粗酶液制備

取酒樣上清液5 mL，在低溫下進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎(功率400 W、破碎時(shí)間15 min、間歇時(shí)間15 min)，10 000 r·min-1離心15 min，棄沉淀，將上清液定容到5 mL即得待測(cè)粗酶液。

1.2.3 精氨酸脫亞胺酶酶活測(cè)定

取500 μL 100 g·L-1的L-精氨酸溶液和400 μL 20 mmol·L-1pH 5.5的磷酸鹽緩沖液于試管中，加入100 μL粗酶液，充分混勻，45 ℃水浴下反應(yīng)10 min，迅速煮沸10 min終止反應(yīng)，10 000 r·min-1離心10 min，測(cè)定上清液瓜氨酸含量。

酶活定義：以1 min產(chǎn)生1 μmol的L-瓜氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.4 精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量測(cè)定

酒樣醪液經(jīng)10 000 r·min-1離心10 min后，準(zhǔn)確移取0.5 mL上清液、0.5 mL 0.5 mol·L-1的NaHCO3溶液0.2 mL和25 mL·L-12,4二硝基氟苯(DNFB)衍生化試劑于10 mL試管中，混合后置于60 ℃水浴中避光恒溫加熱60 min，避光冷卻至室溫后用pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液定容至5 mL，靜置15 min，過0.22 μm膜后進(jìn)樣分析。

采用戴安U-3000高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，其中色譜柱為Acclaim120，C18，5 μm Analytical(4.6 mm×250 mm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃，流動(dòng)相B為超純水，流動(dòng)相C為乙腈溶液，流動(dòng)相D為乙酸鈉，流速0.8 mL·min-1，時(shí)間26 min。梯度洗脫程序如下：0 min，流動(dòng)相B、C、D的體積分?jǐn)?shù)分別為15%、15%、70%；13 min，流動(dòng)相B、C、D的體積分?jǐn)?shù)分別為31%、31%、38%；21 min，流動(dòng)相B、C、D的體積分?jǐn)?shù)分別為34%、34%、32%；23 min，流動(dòng)相B、C、D的體積分?jǐn)?shù)分別為50%、50%、0；26 min，流動(dòng)相B、C、D的體積分?jǐn)?shù)分別為15%、15%、70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶的形成動(dòng)力學(xué)

如表1所示，黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶的活性隨著時(shí)間推進(jìn)而有所不同：直到釀造的第4天，才檢測(cè)到精氨酸脫亞胺酶活性，此后其活性逐步增加，第10天時(shí)其活性達(dá)到72 U·mL-1，之后一直到第24天酶活變化不大，基本維持在72～76 U·mL-1，隨后精氨酸脫亞胺酶活性再次逐步增加，第44天時(shí)達(dá)到146 U·mL-1，此后又維持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)。

黃酒釀造過程中的精氨酸脫亞胺酶的活性變化可以分為2個(gè)階段：4～12 d為第1階段，24～44 d為第2階段。分別對(duì)這2個(gè)階段的精氨酸脫亞胺酶活性做動(dòng)力學(xué)分析，得到2個(gè)擬合模型(y為酶活，x為時(shí)間)：

第1階段的擬合模型為y=1.5x4-20.667x3+98.5x2-177.33x+144(R2=1.000)；

第2階段的擬合模型為y=-0.049 8x4+1.265 9x3-9.898 9x2+30.604x+51.758(R2=0.994 6)。

R2均大于0.99，說明回歸擬合效果好。

表1 黃酒釀造過程中精氨酸、瓜氨酸含量和精氨酸脫亞胺酶活性的變化

注：-表示沒有檢到。

對(duì)醪液中精氨酸脫亞胺酶催化產(chǎn)物瓜氨酸的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在釀造的前14 d均未能檢測(cè)到瓜氨酸，此后瓜氨酸的含量逐步增加，到24 d后瓜氨酸的含量相對(duì)穩(wěn)定，自38 d開始稍有下降，但相對(duì)穩(wěn)定。醪液中的精氨酸含量從釀造開始就逐步增加，至34 d時(shí)達(dá)到較高水平，此后精氨酸的含量保持相對(duì)穩(wěn)定。

通過對(duì)黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶活性及其酶解產(chǎn)物含量的定量分析，發(fā)現(xiàn)了精氨酸脫亞胺酶的階段性變化特征，并且酶活呈上升趨勢(shì)；但是，在精氨酸含量逐步增加的情況下，瓜氨酸的含量在24 d后卻沒有明顯增加。這可能是因?yàn)楣习彼岢掷m(xù)轉(zhuǎn)化成了鳥氨酸。精氨酸脫亞胺酶和鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶是同簇基因，它們的轉(zhuǎn)錄是同步進(jìn)行的。

2.2 醪液中精氨酸脫亞胺酶的催化特性

2.2.1 溫度對(duì)精氨酸脫亞胺酶活性的影響

溫度是影響酶催化的重要因子，考查精氨酸脫亞胺酶在不同溫度條件下的酶活，確定其受溫度影響的程度。結(jié)果(圖1)表明，隨著反應(yīng)溫度提高，精氨酸脫亞胺酶催化產(chǎn)瓜氨酸的酶活先顯著增高后下降，在60 ℃時(shí)酶活最高。

圖1 溫度對(duì)精氨酸脫亞胺酶活性的影響

2.2.2 pH值對(duì)精氨酸脫亞胺酶活性的影響

比較不同pH值的緩沖體系對(duì)精氨酸脫亞胺酶催化活性的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)pH值為6～7時(shí)，酶活較大。黃酒釀造中醪液的pH值通常在3～4，精氨酸脫亞胺酶在pH值為4時(shí)的酶活是pH值為3時(shí)的2倍，由此可知，精氨酸脫亞胺酶活性受醪液pH值影響顯著，控制醪液pH值會(huì)對(duì)醪液中精氨酸的代謝產(chǎn)生重要影響。

圖2 pH值對(duì)精氨酸脫亞胺酶活性的影響

2.3 精氨酸代謝對(duì)黃酒中氨基甲酸乙酯形成的影響

根據(jù)對(duì)黃酒中精氨酸脫亞胺酶的初步研究結(jié)果，比較不同釀造條件下產(chǎn)品中的EC含量，確定精氨酸代謝對(duì)EC形成的影響。結(jié)果(表2)表明，當(dāng)起始pH值為3時(shí)，醪液中的精氨酸脫亞胺酶活性受到明顯抑制，分別為對(duì)照組(pH值為3.5)和起始pH值為4時(shí)的23%和22%，且產(chǎn)品中的EC含量也只有對(duì)照組和起始pH值為4時(shí)的35%和32%，說明控制釀造過程的pH值對(duì)精氨酸脫亞胺酶活性和EC形成均有顯著作用。

表2 起始pH值對(duì)氨基甲酸乙酯形成的影響

3 小結(jié)與討論

氨基甲酸乙酯的大部分前體物質(zhì)來源于發(fā)酵過程的微生物代謝，通過代謝過程控制或者菌種選育減少前體物質(zhì)的形成，可以減少產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯[4]。利用精氨酸代謝酶抑制劑控制瓜氨酸等前體物質(zhì)的形成[5]；精氨酸酶缺陷型或表達(dá)受阻的酵母突變菌株不能轉(zhuǎn)化精氨酸形成尿素[6-8]；將脲基酰胺酶基因整合到酵母菌中，提高脲基酰胺酶的表達(dá)能力，可以降低尿素含量[9]；精氨酸轉(zhuǎn)化能力受阻的酒類酒球菌不能轉(zhuǎn)化精氨酸為瓜氨酸和氨甲酰磷酸[10]，利用以上方法或菌株生產(chǎn)的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量顯著下降。酒中氨基甲酸乙酯的形成機(jī)理不同，控制方法各異。

通過對(duì)黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶活性動(dòng)力學(xué)及其底物、產(chǎn)物的過程分析，初步掌握了黃酒中精氨酸的代謝過程。根據(jù)精氨酸脫亞胺酶的酶學(xué)性質(zhì)，建立了一個(gè)控制精氨酸酶解產(chǎn)瓜氨酸和氨甲酰磷酸的工藝措施，降低了醪液中氨基甲酸乙酯前體物濃度，產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯含量得到有效控制。結(jié)果表明，降低黃酒起始pH值對(duì)于控制產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的形成是一個(gè)切實(shí)可行的工藝措施。