王艷婷，郭妍宏，王飛艷，方譽民，夏鵬國，梁宗鎖，楊東風(fēng)

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室，浙江 杭州 310018)

丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)干燥根和根莖，具有保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗纖維化等作用[1-2]。藏丹參(SalviacastaneaDiels f.tomentosaStib)產(chǎn)于西藏林芝地區(qū)，當(dāng)?shù)蒯t(yī)師把它的根和根莖作為丹參的替代品使用[3]。二氫丹參酮Ⅰ(dihydrotanshinone Ⅰ)、隱丹參酮(cryptotanshinone)、丹參酮Ⅰ(tanshinone Ⅰ)和丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)等丹參酮和迷迭香酸(rosmarinic acid)、咖啡酸(caffeic acid)和丹酚酸B(salvianolicacid B)等酚酸是丹參的活性成分[4]。萜類化合物是植物次生代謝物質(zhì)中最大的一個家族，其生物合成途徑包括發(fā)生在胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑(MVA)和發(fā)生在質(zhì)體的赤蘚糖磷酸途徑(MEP)[5]。酚酸生物合成與苯丙烷途徑和酪氨酸途徑有關(guān)。藏丹參和丹參活性成分相似，但含量差異較大。丹參的丹酚酸B含量更高，藏丹參丹參酮ⅡA和迷迭香酸的含量更高[6]，然而兩種丹參活性物質(zhì)積累差異的形成機制尚不明確。

轉(zhuǎn)錄因子可以整合內(nèi)部(通常是發(fā)育)和外部(環(huán)境)信號來調(diào)節(jié)酶基因表達(dá)，從而控制次級代謝物的特定積累[7]。MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與苯丙烷類代謝途徑和萜類代謝途徑的調(diào)控，歐芹、玉米、金魚草、擬南芥、苦蕎麥和矮牽牛中黃酮類的合成均受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[7-9]，MYB轉(zhuǎn)錄因子也參與調(diào)控了丹參、擬南芥、火炬松中萜類化合物的合成[10-12]；金魚草、龍膽中黃酮類的合成均受bHLH轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[13-14]；bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控紅豆杉和丹參中萜類成分，長春花和黃連中生物堿類成分的積累，也已有報道[15-19]。本文通過比較紫花丹參和藏丹參毛狀根中MYB和bHLH基因表達(dá)的差異，分析可能參與調(diào)控丹參酮和丹酚酸的轉(zhuǎn)錄因子基因，以期揭示藏丹參和紫花丹參次生代謝的差異機制，為丹參酮和丹酚酸的合成及其調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834侵染丹參和藏丹參無菌苗獲得丹參和藏丹參毛狀根(種質(zhì)來源由浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院梁宗鎖教授鑒定)。

基因和蛋白序列：GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

試劑：多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa公司)，熒光定量PCR引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

儀器：熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex，ABI)。

1.2 蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA7.0中的NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，參數(shù)選擇Bootstrap為1 000。

1.3 實驗方法

1.3.1 丹參毛狀根培養(yǎng)

配制MS液體培養(yǎng)基，調(diào)pH值至5.8；0.2 g新鮮的毛狀根被轉(zhuǎn)至培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床中暗培養(yǎng)(25 ℃、110 r·min-1)24 d后采樣。

1.3.2 基因表達(dá)分析

參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(PrimeScriptTMRT reagent Kit)。采用SYBR Premix ExTaqTMⅡ進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物序列見表1，SmActin基因用作內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，58 ℃、30 s，40個循環(huán)?；虮磉_(dá)分析用比較CT法(2-ΔΔCT)。

表1 實時熒光定量PCR引物

表1(續(xù))

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism7作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 藏丹參和丹參毛狀根中MYB表達(dá)差異

MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅僅在植物細(xì)胞形態(tài)及模式建成、生長發(fā)育、逆境脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，在生理活動代謝、初生和次生代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)也扮演者重要角色[20]。自從第一個MYB轉(zhuǎn)錄因子MYBC1(和細(xì)胞色素合成有關(guān))在玉米中被鑒定[21]，各類MYB基因從各種植物中分離鑒定。截至2019年3月17日，NCBI(National Center for Biotechnology Information)中MYB基因已至59 586條。MYB是調(diào)節(jié)丹參酮和丹酚酸的調(diào)控因子。為了研究不同的轉(zhuǎn)錄因子在藏丹參和丹參的表達(dá)差異，對47個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行了基因表達(dá)分析。結(jié)果表明，24個MYB(SmMYB60、SmMYB98、SmMYB87、SmMYB29等)在丹參中的表達(dá)顯著高于藏丹參，其中SmMYB60表達(dá)高達(dá)藏丹參的1 726.23倍，SmMYB98表達(dá)高達(dá)707.33倍(圖1中a)。SmMYB42、SmMYB34、SmMYB107、SmMYB85等4個MYB基因(圖1中c)在藏丹參中表達(dá)較高，分別高達(dá)丹參2.45、4.24、5.95、114.90倍。SmMYB96、SmMYB94、SmMYB80、SmMYB64等19個基因(圖1中b)表達(dá)在兩種丹參中表達(dá)差異不顯著。

SM，丹參；SC，藏丹參。圖3同。圖1 MYB基因的表達(dá)模式

Li等[11]首次對丹參中MYB轉(zhuǎn)錄因子做了系統(tǒng)的分析，他們報道了110個R2R3-MYB基因，并且預(yù)測第4、5和20亞組的SmMYB可能參與調(diào)控了萜類化合物生物合成[11]。SmMYB36轉(zhuǎn)錄因子基因是一個典型的R2R3轉(zhuǎn)錄因子，SmMYB36含有第四和第五亞族特有的DNEI結(jié)構(gòu)，團(tuán)隊前期克隆得到了SmMYB36轉(zhuǎn)錄因子基因，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SmMYB36促進(jìn)了丹參酮的積累，但抑制了丹參中酚酸和類黃酮的生物合成[22]。序列分析SmMYB36和SmMYB34進(jìn)化樹在同一分支(圖2)，實驗表明，SmMYB34在藏丹參中的表達(dá)量是丹參的4.43倍，SmMYB34可能與藏丹參對丹參酮的高積累有關(guān)。SmMYB39轉(zhuǎn)錄因子基因[23]和Li等[11]注釋的SmMYB76基因?qū)儆谕粭l基因，為第4亞組[11]，研究表明，SmMYB76可以抑制丹酚酸的積累。在本研究中SmMYB76和SmMYB28在同一分支(圖2)，與前人研究一致[11]，本實驗中它在丹參中的表達(dá)量是藏丹參的8.18倍，這很可能與藏丹參低丹酚酸B積累有關(guān)。

●丹參中表達(dá)量較高；■藏丹參中表達(dá)量較高。圖4同。圖2 丹參MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹

丁慶倩等[24]從大豆中鑒定出一個在脅迫條件下明顯上調(diào)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子SiMYB42。藏丹參(海拔2 900～3 500 m林芝地區(qū))相對丹參(平原)面臨更多的高UV-B輻射等逆境壓力[25]。研究發(fā)現(xiàn)，酵母提取物和水解乳蛋白可以提高藏丹參和丹參中丹參酮的含量，并且藏丹參對酵母提取物的影響反應(yīng)更大[26-27]。在玉米種MYB42與木質(zhì)素含量的負(fù)調(diào)節(jié)有關(guān)[28]，木質(zhì)素和酚酸生物合成都源于苯丙烷途徑。在本實驗中SmMYB42在藏丹參中的表達(dá)量是丹參的2.45倍，根據(jù)這些，推測SmMYB42在酚酸的積累過程發(fā)揮著重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SmMYB98b毛狀根株系中丹參酮含量和丹參酮合成通路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)都有所提高。干擾SmMYB98b毛狀根株系中丹參酮含量和丹參酮合成通路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)都被抑制[29]。在本實驗中在丹參中的表達(dá)量高達(dá)藏丹參的707.33倍，SmMYB98可能酚酸的積累過程也扮演重要的角色。在草莓中FaMYB10正調(diào)節(jié)花青素的積累[30]，花青素等酮類的合成與酚酸的合成都依賴于PAL途徑，本實驗中SmMYB10在丹參中的表達(dá)量高達(dá)藏丹參的6.12倍，MYB10轉(zhuǎn)錄因子基因也可能是酚酸積累的一個重要調(diào)控因子。在蘋果中MYB22過表達(dá)株系花青素的積累和CHS、CHI、F3H等花青素通路關(guān)鍵酶基因的表達(dá)都被抑制，本實驗中SmMYB22在丹參中的表達(dá)量高達(dá)藏丹參的16.79倍，SmMYB22可能與藏丹參高迷迭香酸積累有關(guān)。

2.2 藏丹參和丹參毛狀根bHLH表達(dá)差異

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控了黃酮類化合物，生物堿和萜類化合物的生物合成。已發(fā)現(xiàn)10 907多個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)完成系統(tǒng)性鑒定和分類的有擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和煙草(NicotianatabacumL.)等[31-33]。為了研究不同的轉(zhuǎn)錄因子在藏丹參和丹參的表達(dá)差異，對47個bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，15個SmbHLH(SmbHLH69、SmbHLH33、SmbHLH123、SmbHLH96等)在丹參中的表達(dá)量顯著高于藏丹參，其中SmbHLH69表達(dá)高達(dá)藏丹參的1 727.61倍，SmbHLH33高達(dá)29.72倍(圖3中b)。SmbHLH48、SmbHLH46、SmbHLH79、SmbHLH108、SmbHLH73和SmbHLH77等6個bHLH基因(圖3中c)在藏丹參中表達(dá)量較高，分別高達(dá)丹參中表達(dá)量的2.51、3.36、8.95、12.36、34.02和124.67倍。SmbHLH121、SmbHLH10、SmbHLH29、SmbHLH26等26個基因(圖3中a)在兩種丹參中表達(dá)量差異不顯著。

圖3 bHLH 基因的表達(dá)模式

Zhang等[34]從丹參基因組中篩選出127個bHLH轉(zhuǎn)錄因子并進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。他們預(yù)測7個可能調(diào)節(jié)丹參酮生物合成的基因，分別為SmbHLH37(亞族R)、SmbHLH51(亞族R)、SmbHLH53(亞族R)、SmbHLH60(亞族W)、SmbHLH74(亞族H)、SmbHLH92(亞族P)和SmbHLH103(亞族P)。丹參SmbHLH10轉(zhuǎn)錄因子基因，它和SmbHLH83基因?qū)儆谕粭l基因[35-36]，前期研究表明，SmbHLH83可以促進(jìn)丹參酮的的積累[23]，在本研究的進(jìn)化樹中單獨一個分支(圖4)，但它在藏丹參和丹參中表達(dá)量差異不顯著，推測SmbHLH83可能不是藏丹參和丹參次生代謝產(chǎn)物積累差異的主要原因。前人的研究表明，SmbHLH48和SmbHLH74同屬亞族H[34]，bHLH48和SmbHLH74序列相似，并且bHLH48在藏丹參中的表達(dá)量是丹參的2.51倍，bHLH48可能和藏丹參高丹參酮積累有關(guān)。

擬南芥MYC2[35]調(diào)節(jié)倍半萜合酶基因表達(dá)，并且丹參酮和倍半萜烯都是萜類化合物[35]。構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹時發(fā)現(xiàn)bHLH51[34]和NtMYC2a，NtMYC2b和CrMYC2在相同的亞家族，并且SmbHLH51在根中表達(dá)水平比在其他3個器官的表達(dá)水平高，在用茉莉酸處理后呈上調(diào)的趨勢。SmbHLH51在丹參中的表達(dá)量是藏丹參的2.78倍，SmbHLH51在丹參酮生物合成中具有一定的調(diào)節(jié)作用。梨的紅色是花青素積累的結(jié)果，SmbHLH33參與花色素苷生物合成的差異調(diào)節(jié)[36]，定量結(jié)果顯示SmbHLH33在丹參中的表達(dá)量高達(dá)藏丹參的29.72倍，苯丙烷代謝也是黃酮類化合物(例如花青素、黃酮、黃酮醇及其糖苷)的上游途徑，花青素都與酚酸生物合成共享相同的前體[37]，SmbHLH33可能參與迷迭香酸和丹酚酸B的生物合成。擬南芥中miR393靶向轉(zhuǎn)錄因子bHLH77和生長素受體TIR1，AFB(1，2，3)[38]，生長素在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，SmbHLH77在藏丹參中的表達(dá)量高達(dá)丹參的155.41倍，可能間接的調(diào)節(jié)丹參次生代謝物質(zhì)的積累。AtbHLH122轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控ABA的積累來參與植物適應(yīng)逆境脅迫。有研究表明，施用適量的赤霉素能促進(jìn)丹參的生長和丹參根中丹參酮類物質(zhì)的積累。SmbHLH122在丹參中表達(dá)量僅僅是藏丹參的2.16倍，暗示轉(zhuǎn)錄因子可能不是藏丹參高丹參酮積累的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[39]。

圖4 丹參bHLH轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 小結(jié)

本研究采用熒光定量PCR分析了MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子在藏丹參與丹參毛狀根中的表達(dá)差異，結(jié)果表明：有24個MYB(SmMYB60、SmMYB98、SmMYB87、SmMYB29等)和15個SmbHLH(SmbHLH69、SmbHLH33、SmbHLH123、SmbHLH96等)在丹參中高表達(dá)，有4個MYB(SmMYB96、SmMYB94、SmMYB80、SmMYB64)和6個SmbHLH(SmbHLH48、SmbHLH46、SmbHLH79、SmbHLH108、SmbHLH73和SmbHLH77)在藏丹參中高表達(dá)。這些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)控了丹參酮和丹酚酸的積累，導(dǎo)致藏丹參和丹參次生代謝的差異。但是這些轉(zhuǎn)錄因子是如何參與代謝目前還不太清楚，需要做進(jìn)一步的研究。本研究為揭示丹參和藏丹參的差異以及丹酚酸、丹參酮的生物合成機制奠定了基礎(chǔ)。