楊 雷，劉 萍，劉 暖，王 倩，毛秉豫

(南陽理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004)

2017年，心血管病研究報(bào)告指出，2015年中國城市、農(nóng)村心血管病死亡占比分別高達(dá)42.61%和45.01%，心肌梗死是引發(fā)死亡的主要原因之一[1]。心梗后梗死區(qū)域周邊和非梗死區(qū)心肌組織容易發(fā)生細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改變心肌的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，造成心臟收縮和舒張功能障礙，引發(fā)心室重塑[2]。因此，預(yù)防和控制心肌細(xì)胞凋亡是減緩心室重塑的有效對(duì)策之一[2]。

心梗心肌組織缺血損傷后，炎癥反應(yīng)調(diào)控蛋白如Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)、黏膠蛋白/肌腱蛋白C(Tenascin-C，TN-C)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)p50、NF-κB p65，炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6等，以及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、caspase-3、Bax激活，啟動(dòng)炎癥和凋亡反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)心室的不良重構(gòu)[3]。蛋白激酶D1(protein kinase D1，PKD1)在心血管系統(tǒng)中，參與血管新生、心肌收縮、心肌重塑等進(jìn)程[4-6]，但其對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用尚不清楚。本研究旨從分子生化角度，分析PKD1給藥對(duì)大鼠心肌梗死后炎癥和凋亡的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45只Wistar大鼠，♂，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。實(shí)驗(yàn)在南陽理工實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)(批準(zhǔn)號(hào)：NYIST-20180128)指導(dǎo)下進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑PKD1，購自美國Pierce公司；caspase-3、Bax、Bcl-2一抗，購自美國Sigma公司；TLR4、TN-C、NF-κB p50、NF-κB p65一抗及RNA提取試劑盒，均購自Santa Cruz上海公司；TUNEL染色試劑盒，購自北京百奧萊博公司；RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0試劑盒，購自大連寶生物公司；IL-1、IL-6、NF-κB p50和NF-κB p65的TaqMan探針，由Annoron北京公司代理設(shè)計(jì)。

1.3 儀器CUT6062型病理切片機(jī)(德國SLEE公司)； NanoDrop-ND2000型紫外超微分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)；T10高速組織勻漿機(jī)(德國IKA公司)；Nikon Tis型熒光顯微鏡及配套分析軟件NIS-Elements Software BR(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模和分組將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組和PKD1組，每組15只。模型組和PKD1組參照之前文獻(xiàn)的方法[5]，通過永久性結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈制作心肌梗死模型；Sham組僅手術(shù)而不結(jié)扎血管。術(shù)后，PKD1組給予1 mg·kg-1·d-1的PKD1，Sham和模型組給予等量生理鹽水，均灌胃7 d。在7 d結(jié)束時(shí)，30 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)評(píng)估。評(píng)估結(jié)束，頸總動(dòng)脈放血法處死動(dòng)物，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)評(píng)估將SPR-838壓力容積導(dǎo)管經(jīng)左頸動(dòng)脈插入麻醉后大鼠的左心室(left ventricle, LV)腔內(nèi)，接入壓力換能器，應(yīng)用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄LV舒張末期容積(end-diastolic volume，EDV)、收縮末期容積(end-systolic volume，ESV)、等容舒張常數(shù)(isovolumic relaxation constant，Tau)、最大壓力導(dǎo)數(shù)(maximum derivative of pressure，Max dp/dt)、最小壓力導(dǎo)數(shù)(minimum derivative of pressure，Min dp/dt)等數(shù)據(jù)。

2.3 HE染色取處死后大鼠的心臟，分離左心室和室間隔前2/3，參照之前文獻(xiàn)的方法[5]，4%多聚甲醛固定，包埋，制作4 μm厚石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡×400放大視野下對(duì)心肌組織進(jìn)行分析。

2.4 TUNEL染色先制作石蠟切片，再參照試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL染色，細(xì)胞核DAPI復(fù)染。熒光顯微鏡下正常細(xì)胞示藍(lán)色，陽性凋亡心肌細(xì)胞示紅色。每張玻片選5個(gè)非重復(fù)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.5 免疫組化取材同HE染色，參照之前文獻(xiàn)的方法[5]，將病理切片常規(guī)脫蠟、修復(fù)并消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液沖洗后，加入抗caspase-3、Bax、Bcl-2的一抗，置4 ℃孵育12 h后，PBS沖洗清除表面雜質(zhì)和一抗；加入羊抗兔二抗，常溫孵育15 min后，加入DAB顯色液孵育3 min，顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)黃色或者棕黃色。每張玻片選5個(gè)非重復(fù)視野，計(jì)數(shù)caspase-3、Bax、Bcl-2陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2.6 免疫印跡取心尖部心肌組織制成組織勻漿后，RIPA細(xì)胞裂解液裂解蛋白，應(yīng)用經(jīng)典的BCA法測(cè)定濃度并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取30 μg總蛋白，94 ℃變性3 min后，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用含5%脫脂乳的TBS緩沖液封閉1 h，添加caspase-3、Bax、Bcl-2、TLR4、TN-C、NF-κB p50、NF-κB p65等一抗，4 ℃孵育12 h。PBS液沖洗3次，二抗(1∶2 000稀釋)孵育1 h后，TBST洗膜，暗室曝光顯影。計(jì)算并記錄各樣本蛋白與β-actin相對(duì)灰度值。

2.7 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明，提取心肌組織總RNA，NanoDrop-ND2000紫外超微分光光度計(jì)基于260 nm/280 nm比值監(jiān)控質(zhì)量，取1 μL RNA，用RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。IL-1、IL-6、NF-κB p50和NF-κB p65基因的mRNA表達(dá)采用TaqMan市售水解探針檢測(cè)，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃，2 min(預(yù)變性)；95 ℃，30 s(變性)；65 ℃，30 s(退火)；60 ℃，30 s(延伸)；40個(gè)循環(huán)。記錄各個(gè)反應(yīng)的Ct值，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，ΔΔCt法分析結(jié)果，按照公式2-ΔΔCt計(jì)算各基因相對(duì)于β-actin內(nèi)參基因的表達(dá)水平。引物序列見Tab 1。

3 結(jié)果

3.1 PKD1對(duì)心梗大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響Tab 2結(jié)果顯示，與Sham組相比，模型組大鼠EDV和ESV值明顯升高(P<0.01)，而Max dp/dt和Min dp/dt值明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，PKD1治療組大鼠EDV和ESV值明顯降低(P<0.01)，而Max dp/dt和Min dp/dt值明顯升高(P<0.01)；PKD1組和模型組Tau值均明顯低于Sham組，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示PKD1可改善EDV、ESV、Max dp/dt、Min dp/dt等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)Tau沒有影響。

3.2 PKD1對(duì)心梗大鼠組織形態(tài)學(xué)的影響Fig 1的HE染色結(jié)果表明，Sham組大鼠組織結(jié)構(gòu)規(guī)則、紅色心肌組織清晰，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠心肌組織壞死比例較高，炎性細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞增生明顯；PKD1治療組大鼠心肌組織恢復(fù)較好，細(xì)胞核較為清晰，少見炎性細(xì)胞浸潤，但細(xì)胞核仍顯肥大。

Tab 1 Sequence of PCR primer

Tab 2 Effect of PKD1 on hemodynamics in rats with myocardial infarction n=15)

Fig 1 Effects of PKD1 on histomorphology of myocardial infarction rats(HE, ×400)

3.3 PKD1對(duì)心梗大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig 2的TUNEL染色分析表明，Sham組和PKD1組大鼠心肌細(xì)胞主要發(fā)出藍(lán)色熒光，個(gè)別細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，模型組大鼠心肌細(xì)胞主要呈紅色熒光。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，Sham組和PKD1組大鼠呈紅色熒光的陽性凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)均明顯少于模型組(P<0.01)。免疫組化和Western blot結(jié)果均表明(Fig 2、3)，模型組大鼠心肌組織中caspase-3、Bax表達(dá)明顯高于Sham組，而Bcl-2表達(dá)明顯低于Sham組(P<0.01)；PKD1治療后，大鼠心肌組織中caspase-3、Bax表達(dá)較模型組明顯降低(P<0.01)，而Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.01)。提示PKD1治療可有效對(duì)抗心梗大鼠心肌組織受損后引起的心肌細(xì)胞凋亡。

3.4 PKD1對(duì)心梗大鼠心肌組織中炎癥反應(yīng)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響Fig 4的結(jié)果證實(shí)，PKD1干預(yù)可明顯下調(diào)模型組大鼠因心肌缺血損傷引起的TLR4、TN-C、NF-κB p50和NF-κB p65的表達(dá)升高(P<0.01)。表明PKD1給藥可有效抑制心梗大鼠心肌組織中的炎癥反應(yīng)。

3.5 PKD1對(duì)心梗大鼠心肌組織中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響如Fig 5所示，PKD1干預(yù)可明顯下調(diào)模型組大鼠因損傷所致的致炎因子IL-1、NF-κB p50和NF-κB p65的mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，但PKD1組和模型組間IL-6 mRNA表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明PKD1可下調(diào)IL-1、NF-κB p50、NF-κB p65 mRNA表達(dá)，但不影響IL-6 mRNA表達(dá)。

4 討論

本研究利用大鼠心肌梗死模型，評(píng)價(jià)PKD1在心肌梗死心肌組織損傷中的抗炎、抗凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)，PKD1治療1周可有助于減輕心肌梗死后缺血心肌組織中的炎癥和凋亡反應(yīng)。

ESV和Max dp/dt反映心臟的收縮功能，EDV和Min dp/dt反映心臟的舒張功能。PKD1可明顯降低ESV和EDV的值，同時(shí)上調(diào)Max dp/dt和Min dp/dt的值。表明PKD1干預(yù)可改善心肌的順應(yīng)性，提高心功能指標(biāo)，在改善心梗大鼠心肌組織的血流動(dòng)力學(xué)方面效果明顯。HE染色結(jié)果表明，心肌梗死后組織壞死和炎性細(xì)胞浸潤明顯，PKD1治療可明顯減輕心肌組織的壞死程度，但心肌細(xì)胞仍明顯肥大，這可能與用藥時(shí)間較短有關(guān)，也可能是PKD1并不明顯抑制心肌肥大。

TUNEL染色結(jié)果表明，心肌梗死后出現(xiàn)大量凋亡的心肌細(xì)胞，而PKD1治療可有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡。免疫組化和免疫印跡結(jié)果均表明，心肌梗死后，心肌組織內(nèi)caspase-3、Bax的表達(dá)明顯升高，Bcl-2的表達(dá)明顯降低，而PKD1治療可有效抑制caspase-3、Bax的上調(diào)，并促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)上調(diào)。文獻(xiàn)研究表明[7-8]，caspase-3、Bax的表達(dá)增多，而Bcl-2表達(dá)減少意味著組織損傷的加重和細(xì)胞凋亡數(shù)量的增多；反之，則表明損傷的減輕和凋亡細(xì)胞數(shù)量的減少。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，PKD1治療能有效抑制心梗后心肌細(xì)胞的凋亡。

心肌梗死后引發(fā)缺血損傷的起始階段，很多炎癥因子被損傷刺激激活，趨向至損傷區(qū)域[9]。在這一階段，炎癥白細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量激增。TLRs是心肌缺血損傷后白細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體[10]，也是一種重要的炎癥反應(yīng)調(diào)控蛋白，可調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)運(yùn)，或者影響炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α等的釋放反應(yīng)[11]。同時(shí)，損傷反應(yīng)也會(huì)刺激誘導(dǎo)炎癥白細(xì)胞釋放更多的炎癥細(xì)胞因子，激發(fā)規(guī)模更大的炎癥反應(yīng)，致使梗死范圍進(jìn)一步擴(kuò)大[12]。其中，IL-1不僅可導(dǎo)致心肌梗死后炎癥反應(yīng)加重，還可引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、纖維化、心肌肥厚等不良后果[13]。心肌細(xì)胞凋亡又會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)和TLRs的激活，并生成大量的氧自由基，進(jìn)而激活心肌細(xì)胞核因子NF-κB，誘發(fā)趨化因子、細(xì)胞因子或黏附分子生成增多[14]。缺氧、活性氧以及TNF-α、IL-1介導(dǎo)的炎性刺激，均可激活NF-κB[14]。在細(xì)胞核中，NF-κB p50/RelA及NF-κB p65可誘導(dǎo)激發(fā)IL-1、IL-6、TNF-α、急性期反應(yīng)蛋白以及黏附分子ICAM-1和YCAM1等的生成增多，參與炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[14]。而且心肌梗死小鼠NF-κB p50基因敲除后，心室重塑可以被逆轉(zhuǎn)[14]。因此，就本研究結(jié)果來看，PKD1治療的有益作用可能與其下調(diào)TLR4、IL-1、NF-κB p50和NF-κB p65的表達(dá)密切相關(guān)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心室重塑和改善心肌功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，PKD1干預(yù)不改變IL-6的表達(dá)水平，這可能是PKD1對(duì)炎性細(xì)胞因子的作用具有一定的選擇性。

Fig 2 Effect of PKD1 on apoptosis of myocardial cells in rats with myocardial infarction vs sham group;##P<0.01 vs model group

Fig 3 Effect of PKD1 on expression of apoptotic regulatory protein in myocardial tissue of rats with myocardial infarction

Fig 4 Effect of PKD1 on expression of inflammatory regulatory protein in myocardial tissue of rats with myocardial infarction

Fig 5 Effects of PKD1 on mRNA expression of inflammatory factors in myocardium of rats with myocardial infarction

TN-C也屬于炎癥的重要標(biāo)志物之一，其本身屬于一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白，參與新膠原分子的形成，并具有調(diào)節(jié)NF-κB活化的作用[15]。敲除TN-C基因可下調(diào)心肌梗塞后心肌組織膠原纖維的占比，增強(qiáng)心肌的順應(yīng)性，抑制心衰的發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PKD1治療可降低TN-C的表達(dá)水平，這可能是通過下調(diào)NF-κB p50和NF-κB p65表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

以上研究表明，PKD1具有調(diào)節(jié)心肌梗死大鼠心肌組織的炎癥反應(yīng)，減輕梗死后心肌細(xì)胞凋亡，改善梗死后血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心室重塑的潛在作用。