張海全,鐘曉坤,黃勤英,農克良

(廣西民族師范學院 廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室,廣西崇左 532200)

肝病是影響人類健康的疾病,但其預防和治療仍存在局限性。對天然產物的活性成分開展研究以尋求安全有效的保肝功能性食品是食品領域研究的熱點。熊果酸具有抗菌[1]、抗炎[2-3]、保肝[4-6]等作用,在食品、藥品領域具有巨大的應用前景[7],未來可作為治療和預防肝病的藥物之一。文獻報道苦丁茶中熊果酸含量高達2.78%[8],可作為熊果酸的重要來源。

張明等[9]利用纖維素酶酶解提取苦丁茶中的熊果酸,提取率為1.26%,較傳統(tǒng)有機溶劑提取法高,表明酶解工藝可替代傳統(tǒng)有機溶劑提取法。此外,微波及超聲法[10]、超臨界CO2萃取法[11]、分子印記固相萃取法[12]等亦可從苦丁茶中提取熊果酸。現有方法仍存在一定缺點,如溶劑消耗量大,提取過程復雜,條件苛刻等,故苦丁茶熊果酸的提取工藝仍需優(yōu)化。酶法提取工藝具有效率高、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點,適用于天然產物活性成分的提取,故可考慮酶法對苦丁茶熊果酸進行提取,并采用響應面法優(yōu)化條件,以期找到最優(yōu)工藝。

研究表明,苦丁茶提取物可有效抑制肝損傷[13],但作用機制尚未明確。苦丁茶熊果酸保肝作用研究鮮有報道,試驗采用響應面法優(yōu)化酶解提取苦丁茶熊果酸的工藝,并探討熊果酸對CCl4致小鼠肝損傷的保護作用,為開發(fā)苦丁茶作為保肝護肝保健品提供一定的理論依據,為苦丁茶熊果酸保肝藥理作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗動物60只昆明種小鼠,4～5周齡,SPF級,雌雄各半,體重18～22 g,來源于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(桂)2014-0001;苦丁茶 湘君大藥房,經廣西民族師范學院農克良教授鑒定為冬青科冬青屬大葉冬青苦丁茶的干燥葉,粉碎過80目篩,備用;熊果酸標準品 廣州分析測試中心;纖維素酶 南寧東恒華道生物科技有限責任公司;聯(lián)苯雙酯滴丸 廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司;谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

UV-6100S紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;分析天平 奧豪斯儀器有限公司;HH-S4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;GZX-GF101-1 BS型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;GMSP-5倒置顯微鏡 上海光學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 熊果酸標準曲線的繪制 以香草醛乙酸溶液和高氯酸為顯色體系,采用紫外分光光度法于548 nm測定不同濃度熊果酸標準品的吸光度,建立熊果酸標準曲線,方程為Y=0.0242X+0.0078(R2=0.9971)。詳細操作見參考文獻[14]。

1.2.2 苦丁茶熊果酸的提取及測定 苦丁茶經粉碎過80目篩,以適量蒸餾水浸泡2 h,加入一定量纖維素酶在一定溫度、pH下酶解一定時間。酶解完成后加熱至100 ℃滅酶,減壓抽濾,濾渣100 ℃烘干?？喽〔铻V渣以液料比為17∶1加入83%的乙醇回流提取1 h,抽濾,濾液減壓濃縮,濃縮物于60 ℃下干燥12 h即得粗產品。

熊果酸含量的計算按下式:

其中:A為提取液的吸光度;V為提取液的體積,mL;N為提取液稀釋的倍數;m為苦丁茶粉末的質量,g。

1.2.3 單因素實驗 分別考察酶解pH、酶解時間、酶解溫度、酶用量對熊果酸含量的影響。設定酶解時間1.0 h,酶解溫度50 ℃,酶用量0.5 g,考察酶解pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5時對熊果酸含量的影響。設定酶解pH5.0,酶解溫度50 ℃,酶用量0.5 g,考察酶解時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h時對熊果酸含量的影響。設定酶解時間1.0 h,酶解pH5.0,酶用量0.5 g,考察酶解溫度為46、48、50、52、54 ℃時對熊果酸含量的影響。設定酶解時間1.0 h,酶解溫度50 ℃,酶解pH5.0,考察酶用量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g時對熊果酸含量的影響。

1.2.4 響應面優(yōu)化試驗 在單因素實驗的基礎上,結合相關研究報道[15-16],以纖維素酶進行試驗,選取酶解溫度、酶解pH、酶解時間為自變量,通過Design-Expert V8.0.6軟件的Box-Behnken功能,采用三因素三水平響應面分析法優(yōu)化酶解苦丁茶熊果酸的提取工藝,設計如表1。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 苦丁茶熊果酸供試品的精制 為獲得精制的熊果酸進行保肝實驗,粗產品按參考文獻[14]的重結晶方式提純,采用高效液相色譜法[17]分析純度。

1.2.6 苦丁茶熊果酸對CCl4致肝損傷小鼠的保護作用 60只昆明小鼠隨機分成6組,即正常組、模型組,聯(lián)苯雙酯組及熊果酸低、中、高劑量組,每組10只。熊果酸低、中、高劑量組小鼠灌胃給藥劑量分別為15、30、60 mg/kg,聯(lián)苯雙酯組灌胃給藥劑量為200 mg/kg,正常組和模型組小鼠給予等體積蒸餾水。給藥7 d后[18],除正常組腹腔注射橄欖油外,其余各組小鼠腹腔注射0.1% CCl4橄欖油溶液20 mL/kg。隨后禁食不禁水16 h,各組小鼠摘除眼球取血,3000 r/min離心10 min,取血清按照試劑盒說明檢測ALT、AST水平。取血后解剖小鼠,取相同部位肝組織,用生理鹽水制備10%的肝組織勻漿,3000 r/min離心10 min,

上清液按照試劑盒說明測定SOD、GSH-Px和MDA的含量;同時取肝右葉,10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,HE染色后,觀察肝組織的病理變化。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

由圖1A可以看出酶解pH對苦丁茶熊果酸的含量影響較大,其隨酶解pH先增大后減小,當酶解pH5.0時纖維素酶酶活力達到最大值,能夠充分水解苦丁茶纖維,破壞細胞壁,充分釋放細胞內的熊果酸,故含量達到最大值。pH過大或過小時其酶活性大大降低,甚至可能會引起部分酶失活,從而影響酶與底物的充分結合,使酶解效果下降,故選取pH5.0為酶解適宜的pH。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 The results of single factor test

由圖1B可知,隨著酶解時間的增加苦丁茶熊果酸的含量先上升后下降,這是因為隨著酶解時間的延長,苦丁茶細胞壁及細胞間層的纖維素阻擋層已被有效破解,活性物質大多已從細胞內擴散到溶液中,細胞內外的物質濃度已達到了一種動態(tài)平衡,酶解時間適宜時剛好能將細胞壁破壞有利于熊果酸的溶出,酶解時間增多,雜質也大量溶出而不利于熊果酸的純化,故適宜的酶解時間應為1.0 h。

由圖1C可知,在酶解溫度46～48 ℃時,苦丁茶熊果酸的含量隨著溫度的升高而增加,48 ℃達到最大值,之后則變化不大。推測其原因可能是溫度升高,可能會引起部分酶失活,喪失催化能力,溫度進一步提高,則不利于酶活力的發(fā)揮,因而提取效果變差,此外溫度升高,有可能破壞熊果酸的結構,故適宜的提取溫度為48 ℃。

由圖1D可知,苦丁茶熊果酸的含量隨酶用量的增大而增大,但是增大的幅度比較小,這是因為當酶濃度達到一定值時,與底物結合達到動態(tài)平衡,再加大酶用量不利于節(jié)約成本。此外可能會引起酶促反應的產物在溶液中積累會對酶促反應造成抑制。故酶用量對苦丁茶熊果酸的含量影響較小,綜合考慮成本情況,選取酶用量為0.5 g。

2.2 響應面法優(yōu)化結果

2.2.1 回歸模型及方差分析 根據響應面試驗的設計方案,以酶解溫度(A)、酶解pH(B)、酶解時間(C)為變量,以熊果酸含量(Y)為響應值,進行擬合得到多元二次回歸擬合方程模型為:Y=37.49-0.15A-0.20B-0.33C+0.015AB+2.29AC+0.24BC-2.81A2-6.38B2-4.63C2,試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface methodolody experiment

由表3可知,模型的F值為65.79,P值<0.0001,失擬項P=0.1005,說明模型具有顯著性,與試驗具有較好的擬合性,誤差小。R2=0.9883,說明模型擬合度較好,用于優(yōu)化酶解提取苦丁茶熊果酸的工藝是可行的。AC、A2、B2、C2的P值均小于0.01,說明酶解溫度和酶解pH的一次項,酶解溫度、酶解時間、酶解pH的二次項對熊果酸含量具有極顯著影響(P<0.01)。通過比較P值和F值可得出各因素的影響大小為:酶解時間>酶解pH>酶解溫度。

表3 響應曲面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 Variance analysis of response surface equations of quadratic regression model

2.2.2 響應面分析 響應面曲面坡度的平緩與陡峭程度反映因素數值變化時對熊果酸含量的響應靈敏程度,響應面圖形的坡度越陡,響應值敏感;等高線形狀為橢圓形則表示兩因素交互作用顯著,圓形則表示兩因素交互作用不顯著。由圖2～圖4可知,酶解溫度與酶解pH的交互作用影響不顯著;酶解溫度與酶解時間的交互作用影響顯著;酶解時間與酶解pH的交互作用影響不顯著。

圖2 酶解溫度與酶解pH對苦丁茶熊果酸含量的影響Fig.2 Effects of enzymolysis temperature and pH on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

圖3 酶解溫度與酶解時間對苦丁茶熊果酸含量的影響Fig.3 Effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

圖4 酶解時間與酶解pH對苦丁茶熊果酸含量的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time and enzymolysis pH on the content of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng

2.2.3 最佳優(yōu)化工藝與驗證試驗 由Design-Expert V8.0.6軟件分析得到最佳提取工藝為:酶解溫度為47.91 ℃,酶解pH為4.99,酶解時間為0.98 h,苦丁茶熊果酸含量為(37.50±0.62) mg/g?？紤]實際操作的可行性,將其優(yōu)化為:酶解溫度為48 ℃、酶解pH為5.0、酶解時間為1.0 h,以優(yōu)化的工藝條件平行三次進行驗證實驗,求平均值。得到苦丁茶熊果酸含量為(37.28±0.89) mg/g,相對標準偏差為2.04%,重復性良好,與模型預測值(37.50±0.62) mg/g相近,表明響應面法酶解提取苦丁茶熊果酸的工藝條件可行性好,與實際情況擬合較好。

2.3 苦丁茶熊果酸的純化精制

AB-8大孔吸附樹脂分離純化并采用乙醇重結晶得到的苦丁茶熊果酸,經高效液相色譜分析純度,結果見圖5。由圖5B可知,經精制后的苦丁茶熊果酸雜質較少,保留時間為15.46 min,采用面積歸一化法計算其純度為93.1%。在16.52 min處為熊果酸的同分異構體齊墩果酸,但含量較少。

圖5 熊果酸標準品(A)和供試品(B)的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of UA standard(A)and sample(B)

2.4 苦丁茶熊果酸對CCl4致肝損傷小鼠的保護作用

2.4.1 苦丁茶熊果酸對CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、GSH-Px和MDA水平的影響 ALT和AST為檢查肝功能的重要指標,當肝細胞腫脹破裂、受損或壞死時,肝細胞內的ALT和AST釋放至血清,導致血清中ALT和AST水平升高;脂質過氧化反應的終產物為MDA,其可與細胞膜蛋白結合生成加醛復合物而破壞生物膜的結構和功能,MDA水平可以反映肝組織脂質過氧化反應的程度;當肝細胞遭到大量氯仿自由基攻擊時,細胞內SOD和GSH-Px會起到清除自由基的作用,SOD和GSH-Px水平的高低反映機體清除自由基的能力,間接反映肝細胞受損的程度。由表4可知,與正常組相比,模型組小鼠血清ALT、AST活性以及肝組織中MDA含量顯著升高(P<0.05);肝組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低(P<0.05),說明CCl4致小鼠肝損傷模型造模成功。與模型組相比,聯(lián)苯雙酯組、熊果酸各劑量組血清ALT和AST活性顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,聯(lián)苯雙酯組、熊果酸各劑量組肝組織SOD和GSH-Px水平顯著提高,并顯著降低MDA水平(P<0.05)。

表4 熊果酸對CCl4致肝損傷小鼠血清ALT、AST水平及肝組織SOD、GSH-Px和MDA水平的影響Table 4 Effects of UA on the level of ALT,AST in serum,SOD,MDA and GSH-Px in liver tissue of CCl4-liver-injury

2.4.2 苦丁茶熊果酸對CCl4致肝損傷小鼠肝組織病變的影響 從圖6可以看出,正常組小鼠肝組織細胞排列整齊,結構完整,無炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肝細胞排列紊亂,結構破損,伴有炎癥細胞浸潤,可見壞死斑點。聯(lián)苯雙酯組小鼠肝細胞排列較整齊,細胞大小較一致,結構較完整,部分細胞腫脹并有少許胞漿疏松和炎癥細胞浸潤,說明聯(lián)苯雙酯對損傷肝細胞具有較好的治療作用。熊果酸低劑量組小鼠肝細胞排列有些紊亂,部分腫脹。熊果酸中、高劑量組小鼠肝細胞排列較整齊,細胞腫脹、炎癥細胞浸潤及壞死情況減少。病理學觀察表明苦丁茶熊果酸能夠減輕CCl4致肝損傷小鼠肝細胞受損程度。

圖6 苦丁茶熊果酸對CCl4致肝損傷小鼠肝組織病變的影響(HE,100×)Fig.6 Effect of UA from Ilex kudingcha C.J.Tseng on liver pathology in induced by CCl4 liver-injuryed mice(HE,100×)

3 結論

試驗采用響應面法優(yōu)化酶解提取苦丁茶中熊果酸的工藝,得到最優(yōu)條件為:酶解溫度為48 ℃,酶解pH為5.0,酶解時間為1.0 h,該條件下熊果酸含量為(37.28±0.89) mg/g,與模型預測值(37.50±0.62) mg/g相近,與實際情況擬合較好。綜合實驗小鼠血清和肝臟中多項生化指標以及肝組織病理形態(tài)觀察結果,苦丁茶熊果酸對CCl4致小鼠肝損傷具有明顯保護作用,可為開發(fā)苦丁茶作為保肝功能性食品提供可靠的理論依據。本文闡明了熊果酸是苦丁茶保肝作用的活性成分之一,但作用機制有待進一步研究,這也是本課題組下一步研究的重點。