鄭常領(lǐng),趙柄舒,王玉華,于寒松,張永生,劉俊梅,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118; 2.吉林華鑫菌業(yè)有限責(zé)任公司,吉林舒蘭 132600)

黑木耳(Auriculariaauricula)是我國(guó)珍貴的食用菌之一[1],東北地區(qū)資源豐富,其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和微量元素等[2],并且還擁有極為豐富的多糖成分[3]。隨著近年來(lái)研究的深入,已發(fā)現(xiàn)木耳多糖具有抗氧化[4-5],抗癌[6],抗凝血[7]以及降低膽固醇[8]等多種功能活性。作為一種天然活性物質(zhì),黑木耳多糖成了食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

多糖的生物活性取決于聚合物的分子性質(zhì),如單糖的分子量,鏈的構(gòu)象,支鏈聚合的程度和糖苷鍵的類型等[9],研究發(fā)現(xiàn),合理的多糖化學(xué)修飾有利于提高多糖的生物活性,如抗氧化[10],抗衰老[11],抗病毒[12]等。多糖的化學(xué)修飾方法主要包括磷酸化、乙酰化、硫酸化等[13],其中磷酸化修飾是多糖支鏈結(jié)構(gòu)中羥基被游離的磷酸根基團(tuán)所取代的過(guò)程[10]。近年來(lái),不少科研人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾后的多糖抗氧化活性顯著提高,如Yuan等[14]的研究表明,磷酸化修飾顯著提高了卡拉膠低聚糖清除DPPH自由基及羥基自由基的能力,表明多糖的抗氧化活性經(jīng)磷酸化修飾后被提高;南征[15]發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾顯著增強(qiáng)了杏鮑菇多糖超氧陰離子及羥基自由基的清除能力;Li等[16]報(bào)道了采用不同的化學(xué)修飾對(duì)芍藥多糖的抗氧化活性的影響,結(jié)果顯示,在羥基自由基清除能力上磷酸化表現(xiàn)出較其他修飾方法更高的清除率,同時(shí)也證明了磷酸化修飾能提高多糖的抗氧化活性。雖然磷酸化修飾在理論上可以提高多糖的抗氧化活性,但目前還沒(méi)有針對(duì)磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性研究的報(bào)道。因此,本研究對(duì)黑木耳胞外多糖進(jìn)行磷酸化修飾,并且通過(guò)測(cè)定其對(duì)DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性,以期為黑木耳多糖的深加工和新型功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳菌種(HX01) 由吉林華鑫菌業(yè)有限責(zé)任公司提供;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、水楊酸、鄰苯三酚 美國(guó)Sigma公司;磷酸二氫鉀(KH2PO4)、三聚磷酸鈉(sodium tripolyphosphate,STPP)、三偏磷酸鈉(sodium trimetaphosphate,STMP)、濃硫酸、濃硝酸、Tris、鉬酸銨、無(wú)水乙醇 以上試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;液體發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L,馬鈴薯浸提液200 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO40.5 g/L,VB10.05 g/L,滅菌后備用。

FDU-7006型真空冷凍干燥機(jī) 韓國(guó)Operon公司;IR-Prestige-21型FTIR光譜儀 日本Shimadzu公司;UV-1700型酶標(biāo)儀 日本Shimadzu公司;DDS-11A型臺(tái)式電導(dǎo)率儀 上海貝威科技有限公司;AVY220型分析天平 Mettler Toledo公司;HH:SY11-Ni型恒溫水浴箱 北京長(zhǎng)豐儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳多糖的制備 參照劉俊梅等[17]的方法,略作修改。無(wú)菌條件下,取直徑約1 cm2的保存于斜面的種子菌絲塊,接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,28 ℃,150 r/min的條件下?lián)e瓶發(fā)酵5 d,得到液體種子。將液體種子按10%的接種量接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于28 ℃,150 r/min 的條件下液態(tài)深層發(fā)酵5 d,得到液態(tài)深層發(fā)酵液。液態(tài)深層發(fā)酵液于5000 r/min離心10 min后收集上清液。上清液濃縮至原體積的1/5倍后,以三倍濃縮液體積的95%乙醇沉淀24 h,之后經(jīng)真空冷凍干燥得到黑木耳多糖粗品。將粗多糖在60 ℃水浴中復(fù)溶,通過(guò)Sevage法除蛋白,H2O2脫色,然后利用透析袋透析除鹽處理后得到黑木耳多糖純品(AAP)。

1.2.2 黑木耳多糖的磷酸化 參照Ye等[18]的方法,略作修改。稱取磷酸化試劑7 g(STPP 5 g+STMP 2 g),溶解于蒸餾水中,定容至100 mL,配制為70 mg/mL的磷酸化試劑。定容后加入AAP 1 g,硫酸鈉5 g,溶解后調(diào)節(jié)pH至9.0,80 ℃條件下反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后,三倍體積的95%乙醇沉淀24 h。5000 r/min離心10 min去除乙醇,將沉淀樣品真空冷凍干燥。凍干樣品在60 ℃復(fù)溶,復(fù)溶樣液于截流分子量為8000～14000 Da的透析袋中透析[19],檢測(cè)樣液中的電導(dǎo)率,當(dāng)電導(dǎo)率降至160 μS/cm時(shí),結(jié)束透析。透析后,樣品濃縮至原體積的1/5倍,濃縮樣品經(jīng)三倍體積的95%乙醇沉淀24 h,除去乙醇后凍干樣品即為磷酸化黑木耳多糖(P-AAP)。

1.2.3 磷酸根含量的測(cè)定 磷酸根含量的測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法[20],以10 μg/mL的KH2PO4為磷酸根標(biāo)準(zhǔn)物。在試管中分別取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mL磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液,用去離子水定容至5 mL。依次添加1 mol/L的Tris 3 mL,20% VC水溶液1 mL,3 mol/L 硫酸溶液1 mL,3%的鉬酸銨溶液1 mL,之后在30 ℃的恒溫條件下反應(yīng)30 min,測(cè)定樣品溶液于580 nm波長(zhǎng)處的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

磷酸化黑木耳多糖中磷酸根的測(cè)定:在燒杯中取0.5 g均勻的樣品,依次加入濃硫酸、濃硝酸各1 mL，并在通風(fēng)櫥中加熱以產(chǎn)生白煙。冷卻至室溫,之后加入1 mL 30% H2O2,再次加熱,重復(fù)上述操作直至不產(chǎn)生白煙,以完全分解有機(jī)物。加入濃度為1 mL的6 mol/L HCl并加熱以分解酸。在進(jìn)行測(cè)定時(shí),取5 mL樣液通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定,并計(jì)算多糖中的磷酸根含量(以P計(jì))。

1.2.4 黑木耳多糖磷酸化修飾的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 磷酸化試劑(STPP與STMP質(zhì)量比) 磷酸化試劑通常由STPP及STMP組成,濃度為70 mg/mL磷酸化試劑更利于磷酸化修飾多糖[21],本實(shí)驗(yàn)選用STPP及STMP質(zhì)量比分別為0∶7、1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1的磷酸化試劑,在反應(yīng)溫度80 ℃,pH=8.0的條件下反應(yīng)5 h后通過(guò)鉬藍(lán)比色法測(cè)定其磷酸根含量,研究不同STPP與STMP質(zhì)量比的磷酸化試劑對(duì)P-AAP中磷酸根含量影響。

1.2.4.2 反應(yīng)時(shí)間 選用STPP及STMP質(zhì)量比為5∶2的磷酸化試劑,在80 ℃和pH=8.0的條件下,分別反應(yīng)2、3、4、5、6 h,研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)P-AAP磷酸根含量的影響。

1.2.4.3 反應(yīng)溫度 選用STPP及STMP質(zhì)量比為5∶2的磷酸化試劑,分別在60、70、80、90、100 ℃,pH8的條件下反應(yīng)5 h。研究不同的溫度對(duì)P-AAP中磷酸根含量的影響。

1.2.4.4 反應(yīng)pH 選用STPP及STMP質(zhì)量比為5∶2的磷酸化試劑,在反應(yīng)溫度80 ℃,pH分別為6、7、8、9、10的條件下反應(yīng)5 h,探究不同反應(yīng)pH對(duì)P-AAP中磷酸根含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化磷酸化條件 在單因素實(shí)驗(yàn)確定各因素取值范圍的基礎(chǔ)上,利用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則。使用P-AAP中磷酸根的含量作為響應(yīng)值,以磷酸化試劑中STPP質(zhì)量(g),反應(yīng)時(shí)間(h),反應(yīng)溫度(℃),反應(yīng)pH為獨(dú)立變量,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),以確定磷酸化修飾的最優(yōu)工藝條件,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Levels and factors of Box-Benhnken design

1.2.6 磷酸化黑木耳多糖的分離純化 多糖在進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)之前有必要對(duì)其進(jìn)行二次純化,以排除其他因素對(duì)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果的影響[22],因此本試驗(yàn)對(duì)磷酸化多糖P-AAP先后通過(guò)DEAE-Sepharose Fast Flow柱以及Sephadex G-100柱進(jìn)行分離純化,以提高磷酸化多糖抗氧化試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.6.1 DEAE-Sepharose Fast Flow凝膠柱分離純化 取磷酸化多糖P-AAP 5 mg,溶于5 mL蒸餾水中,加入到DEAE-Sepharose Fast Flow柱(1.6 cm×30 cm)中,以0、0.1、0.3、0.5、1 mg/mL的NaCl 溶液梯度洗脫,流速為1 mL/min。逐管收集洗脫液,每管收集5 mL,苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量,并繪制曲線。

收集到的不同多糖洗脫液組分,經(jīng)濃縮,冷凍干燥后得到磷酸化多糖的各個(gè)組分。

1.2.6.2 葡聚糖凝膠G-100柱純化 取1.2.6.1中收集到的組分5 mg,溶于5 mL蒸餾水中,加入到Sephadex G-100柱(1.6 cm×30 cm)中,以蒸餾水進(jìn)行洗脫,流速為0.5 mL/min,每管收集3 mL,苯酚硫酸法檢測(cè)多糖含量,并繪制曲線。收集到的多糖洗脫液,經(jīng)濃縮,冷凍干燥后得到磷酸化多糖組分。

1.2.7 紅外光譜分析 使用FTIR光譜儀測(cè)定多糖的紅外光譜。純化后的P-AAP及AAP用光譜級(jí)KBr粉末以1∶200的比例研磨后壓片,在4000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量。

1.2.8 DPPH自由基清除能力試驗(yàn) 參照You等[23]的方法,略作修改。在比色管中添加3 mL的5 mmol/L DPPH-乙醇溶液,不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖樣液1 mL。搖勻后,在黑暗中靜置30 min。于517 nm處測(cè)定吸光值,記為A1;樣品溶液用1 mL無(wú)水乙醇代替,517 nm處吸光值分別記為A0;用3 mL蒸餾水代替DPPH-乙醇溶液,517 nm處吸光值分別記為A2。VC作為參照物。按照式(1)計(jì)算多糖對(duì)DPPH自由基的清除率。

式(1)

1.2.9 羥基自由基清除能力試驗(yàn) 采用水楊酸法測(cè)定,參照Sun等[24]的方法,稍作修改。依次向比色管中加入9 mmol/L FeSO41 mL,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖樣液1 mL,加入8.8 mmol/L H2O21 mL后搖勻,在37 ℃下反應(yīng)30 min,于510 nm處測(cè)定樣液的吸光值,記為A1。用1 mL蒸餾水代替樣液,記510 nm處吸光值為A0;用1 mL蒸餾水代替H2O2溶液,記517 nm處吸光值為A2。以VC為參照物。以公式(1)計(jì)算多糖對(duì)羥基自由基的清除率。

1.2.10 超氧陰離子自由基清除能力試驗(yàn) 采用鄰苯三酚法[25]測(cè)定,在比色管中加入0.05 mol/L,pH7.4的Tris-HCl緩沖液3 mL,不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)的多糖樣液1 mL,60 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL,快速混合,每隔30 s測(cè)定325 nm處吸光值,直至300 s,A0=A300 s-A30 s;以1 mL蒸餾水替代樣液,325 nm處吸光值,A1=A300 s-A30 s。以VC為參照物。按照式(2)計(jì)算多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定三次,采用Origin 2017軟件作圖分析結(jié)果,利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)并分析數(shù)據(jù),采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 磷酸化試劑對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 以黑木耳胞外多糖中磷酸根含量作為磷酸化修飾程度的評(píng)價(jià)指標(biāo),磷酸根含量越高表示磷酸根基團(tuán)接枝率越高,修飾程度也越高[26]。由表2可知,單獨(dú)使用STPP或STMP的磷酸化試劑后多糖的磷酸根含量均不及二者復(fù)合使用時(shí)磷酸根的含量,說(shuō)明反應(yīng)中二種試劑相互影響,使多糖中磷酸根含量發(fā)生變化。磷酸化試劑中STPP質(zhì)量在1～5 g的范圍內(nèi)時(shí),隨著STPP質(zhì)量的增加,磷酸根的含量呈上升趨勢(shì),當(dāng)磷酸化試劑中STPP質(zhì)量達(dá)到5 g時(shí),磷酸根含量達(dá)到最大值,為7.94%。隨后當(dāng)磷酸化試劑中STPP質(zhì)量為6 g時(shí)磷酸根含量呈下降趨勢(shì),因?yàn)榱姿峄噭┲蠸TPP質(zhì)量達(dá)到一定值后會(huì)導(dǎo)致黑木耳多糖結(jié)構(gòu)的破壞[27],從而影響多糖中磷酸根的含量。因此,選擇磷酸化試劑中STPP質(zhì)量為5 g進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表2 磷酸化試劑對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Table 2 Effect of phosphorylation reagents on the content of phosphate group in AAP

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 由圖1可知,反應(yīng)時(shí)間在2～5 h范圍內(nèi)時(shí),隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),磷酸根的含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì),其中反應(yīng)時(shí)間為5 h時(shí),黑木耳多糖磷酸根含量達(dá)到最大值,為8.02%。但當(dāng)時(shí)間達(dá)到6 h時(shí),磷酸根的含量有所下降,這是由于高溫下長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)有所破壞,導(dǎo)致磷酸根含量降低[28]。因此,選擇反應(yīng)時(shí)間為5 h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Fig.1 Effect of reaction time on the content of phosphate group in AAP

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 從圖2可以看出,在溫度為60～100 ℃范圍內(nèi)時(shí),溫度升高,磷酸根含量增加,在90 ℃達(dá)到最大值，為8.19%。然而,當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí),由于過(guò)高的溫度導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞,從而磷酸根含量降低[28]。因此,選擇反應(yīng)溫度為90 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on the content of phosphate group in AAP

2.1.4 反應(yīng)pH對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響 由圖3可知,堿性條件下對(duì)于磷酸根接枝于黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)上更加有利,因?yàn)樘擒真I在酸性條件下容易水解,多糖降解嚴(yán)重[29-30]。pH在6.0～9.0時(shí),磷酸根含量逐漸上升,其原因是因?yàn)閴A性條件下更利于磷酸根的接支作用。當(dāng)pH為9.0時(shí),磷酸根含量達(dá)到最大值,為8.15%。但當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí),磷酸根含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這是由于過(guò)高的堿性環(huán)境會(huì)抑制磷酸化試劑的接枝作用所造成的[31]。因此,選擇反應(yīng)pH為9.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 反應(yīng)pH對(duì)黑木耳多糖中磷酸根含量的影響Fig.3 Effect of pH on the content of phosphate group in AAP

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黑木耳多糖磷酸化修飾條件的結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素優(yōu)化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以磷酸化試劑中STPP的質(zhì)量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)pH為自變量,黑木耳多糖中磷酸根含量作為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn),試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 磷酸化修飾參數(shù)響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Optimization of response surface analysis and design of phosphorylated conditions

2.2.2 回歸模型方差分析 回歸模型方差以及顯著性分析的結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析數(shù)據(jù)Table 4 Variance analysis data of regression model

Y=-304.00333+9.63583A+3.59982B+21.63317C+15.00583D-3.5×10-3AB+0.105AC-0.4275AD-0.04375BC-5.5×10-3BD+0.215CD-0.81925A2-0.018018B2-1.12175C2-1.40925D2

由表4可知,因素中一次項(xiàng) B、C,二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2對(duì)磷酸根含量具有極顯著的影響,表明各因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,其中AD、BC對(duì)磷酸根含量影響顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 各因素以及兩兩因素之間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響情況可以直觀地從響應(yīng)面圖形中反映出來(lái)[32]。如圖4、圖5顯示了黑木耳多糖磷酸根含量的3D響應(yīng)面圖及等高線圖。

圖4 STPP質(zhì)量及反應(yīng)時(shí)間對(duì)磷酸根含量的影響Fig.4 Effect of STPP addition and reaction time on the content of phosphate group

圖5 反應(yīng)pH及反應(yīng)溫度對(duì)磷酸根含量的影響Fig.5 Effect of pH and reaction temperature on the content of phosphate group

由圖4～圖5可以看出,磷酸化試劑中STPP質(zhì)量與反應(yīng)時(shí)間以及溫度與pH之間有交互作用。且圖4～圖5中響應(yīng)面圖形開(kāi)口向下,有最大值,表明此模型可進(jìn)行最優(yōu)結(jié)果分析。通過(guò)軟件優(yōu)化,以磷酸根含量為指標(biāo),得到磷酸化修飾黑木耳多糖的工藝參數(shù)為磷酸化試劑中STPP質(zhì)量為4.93 g,反應(yīng)溫度88.16 ℃,反應(yīng)時(shí)間5.06 h,反應(yīng)pH為8.64,磷酸根含量預(yù)期值為9.84%?？紤]到實(shí)際條件,參數(shù)確定為磷酸化試劑中STPP質(zhì)量為5 g,STMP質(zhì)量2 g,反應(yīng)溫度88 ℃,反應(yīng)時(shí)間5 h,反應(yīng)pH為8.6。在當(dāng)前條件下,對(duì)AAP進(jìn)行磷酸化修飾,測(cè)得磷酸根含量為(9.93%±0.21%,n=3),與預(yù)期值接近,說(shuō)明該模型可應(yīng)用于磷酸化修飾黑木耳多糖。

2.3 磷酸化多糖的分離純化結(jié)果

如圖6,磷酸化黑木耳多糖P-AAP經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析,分別于蒸餾水以及0.1 mol/L的NaCl兩個(gè)洗脫溶液處得到了2個(gè)洗脫峰。由于第二個(gè)峰不易收集,所以對(duì)第一個(gè)峰收集,之后經(jīng)濃縮,真空冷凍干燥,命名為P-AAP1,進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖6 磷酸化多糖P-AAP的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫曲線Fig.6 Chromatography of P-AAP on DEAE-Sepharose Fast Flow

如圖7,P-AAP1經(jīng)Sephadex G-100柱純化后,在蒸餾水的洗脫下得到一個(gè)單一對(duì)稱峰,表明該多糖組分無(wú)其他雜質(zhì),P-AAP1磷酸化多糖組分經(jīng)濃縮,真空冷凍干燥后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖7 磷酸化多糖P-AAP1的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.7 Chromatography of P-AAP1 on Sephadex G-100

2.4 磷酸化黑木耳多糖的紅外光譜分析結(jié)果

AAP及P-AAP1在4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜圖結(jié)果如圖8所示。

圖8 黑木耳多糖AAP及磷酸化黑木耳多糖P-AAP1的紅外光譜圖Fig.8 Infrared(IR)analysis of AAP and P-AAP1

該吸收峰為典型的多糖吸收峰并且磷酸化前后峰型未發(fā)生較大變化,說(shuō)明多糖的主體結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化[33]。P-AAP1和AAP在3336 cm-1處的吸收峰為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰,表明P-AAP1和AAP中含有分子內(nèi)氫鍵[34];2931、1417 cm-1處為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰,為糖類的特征吸收峰[35];其中1668 cm-1處的吸收峰是羰基C=O鍵的吸收峰;1021 cm-1處的吸收峰表明P-AAP1和AAP為吡喃糖[36]。除此之外,P-AAP1在1215 cm-1處的吸收峰為P=O鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰,903 cm-1處的吸收峰為P-O-C鍵的吸收峰[37],這兩個(gè)峰的變化表明有磷酸基團(tuán)接入。綜上,磷酸化修飾黑木耳多糖成功,所得產(chǎn)物為磷酸化黑木耳多糖。

2.5 磷酸化黑木耳多糖的抗氧化活性分析結(jié)果

2.5.1 DPPH自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的DPPH自由基的清除率結(jié)果如圖9所示。

圖9 磷酸化黑木耳多糖的DPPH自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of DPPH radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由圖9可知,P-AAP1在一定濃度范圍內(nèi),濃度與清除率呈現(xiàn)量效關(guān)系,并且濃度越高,多糖對(duì)DPPH自由基的清除率越高。在濃度為5 mg/mL時(shí),P-AAP1和AAP的清除率分別為87.97%、53.60%,P-AAP1較AAP的清除率提高了34.37個(gè)百分點(diǎn),說(shuō)明磷酸化修飾提高了黑木耳多糖清除DPPH自由基的能力。更低的半抑制濃度IC50值反應(yīng)了更強(qiáng)的清除自由基能力[38],P-AAP1、AAP及VC的IC50值分別為1.07、3.14、0.19 mg/mL,P-AAP1的IC50值雖高于VC,但低于AAP,說(shuō)明磷酸化修飾可以提高黑木耳多糖清除DPPH自由基的能力。Deng等[39]證明了大型真菌竹蓀中的多糖,經(jīng)磷酸化修飾后提高了多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力,并且同樣擁有劑量依賴性。

2.5.2 羥基自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的羥基自由基的清除率結(jié)果如圖10所示。

圖10 磷酸化黑木耳多糖的羥基自由基的清除率Fig.10 Scavenging rate of hydroxyl radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由圖10可知,P-AAP1和AAP對(duì)羥基自由基都有的清除作用,并且反映出清除率對(duì)多糖濃度具有依賴性。在濃度為5 mg/mL時(shí),P-AAP1和AAP的清除率分別為86.63%、56.24%,P-AAP1較AAP的清除率提高了30.39個(gè)百分點(diǎn),表明磷酸化修飾后對(duì)羥基自由基的清除作用有所提高。P-AAP1的IC50值為0.91 mg/mL,高于VC的IC50值0.42 mg/mL,但低于AAP的IC50值3.34 mg/mL,說(shuō)明黑木耳多糖經(jīng)磷酸化修飾后可以有效的提高其清除羥基自由基的能力。Guo等[40]對(duì)乳酸乳球菌的胞外多糖進(jìn)行磷酸化修飾后證明了同樣的結(jié)論。

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力分析 AAP及P-AAP1的超氧陰離子自由基的清除率結(jié)果如圖11所示。

圖11 磷酸化黑木耳多糖的超氧陰離子自由基的清除率Fig.11 Scavenging rate of superoxide anion radical by phosphated Auricularia auricular polysaccharides

由圖11可知,P-AAP1對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力在濃度的增加的同時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在濃度為5 mg/mL時(shí),P-AAP1和AAP的清除率分別為81.26%、54.86%,P-AAP1較AAP的清除率提高了26.40個(gè)百分點(diǎn),表明磷酸化修飾后提高了黑木耳多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。P-AAP1、AAP和VC的IC50值分別為0.41、2.24、0.12 mg/mL,P-AAP1的IC50值雖高于VC的IC50值,但相對(duì)于AAP的IC50值明顯降低,表明磷酸化修飾可以提高黑木耳多糖清除超氧陰離子的能力,而且與其他兩種自由基清除能力相比,P-AAP1對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力,表現(xiàn)的更突出。孫婕等[41]對(duì)南瓜多糖磷酸化修飾后也證明了同樣的結(jié)論,即磷酸化后的多糖具有對(duì)超氧陰離子更強(qiáng)的清除能力。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后,得到磷酸化修飾黑木耳多糖的最優(yōu)工藝參數(shù),在最優(yōu)工藝參數(shù)下多糖中磷酸根含量為9.93%,與模型預(yù)期值9.84%接近。紅外光譜試驗(yàn)結(jié)果顯示磷酸化修飾前后多糖的主體結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化,并且多糖結(jié)構(gòu)中有磷酸基團(tuán)的出現(xiàn),說(shuō)明磷酸化修飾成功?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明,P-AAP1較AAP具有更強(qiáng)的抗氧化活性。其中P-AAP1在濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率為87.97%,IC50值為1.07 mg/mL;濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率為86.63%,IC50值為0.91 mg/mL;濃度為5 mg/mL時(shí),對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為81.26%,IC50值為0.41 mg/mL。本試驗(yàn)中三種自由基清除率均提升,IC50值均降低,說(shuō)明通過(guò)磷酸化修飾的方法能夠提高黑木耳多糖的抗氧化活性。

多糖的抗氧化活性是因其含有的羥基和糖蛋白復(fù)合物而產(chǎn)生的,黑木耳多糖經(jīng)過(guò)磷酸化修飾后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了衍生,從而生物活性發(fā)生改變,進(jìn)一步影響黑木耳多糖的抗氧化活性。也有學(xué)者認(rèn)為多糖經(jīng)化學(xué)修飾,化學(xué)基團(tuán)取代多糖上的羥基后,結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,更多的羥基被暴露從而抗氧化活性增強(qiáng)。但目前磷酸化黑木耳多糖的抗氧化作用機(jī)理還不明確,仍需進(jìn)一步探討研究。