陳 悅,劉冬梅,許丹云,王媛媛,馬愛民

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070)

香灰菌(Hypoxylonsp.)是一種非致病性真菌,作為銀耳的伴生菌,它能夠分解基質(zhì),為銀耳提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì),促進銀耳的生長發(fā)育[1]。香灰菌在生長過程中會產(chǎn)生并分泌大量的天然黑色素,具有抗氧化能力,能夠提高多酚氧化酶的活力[2],可應(yīng)用于食品及飲料色澤、品質(zhì)的改善[3]。香灰菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物(VOCs),包括烷烴類、烯烴類、酮類、芳香族化合物等,可作為生物燃料、天然風味化合物、抗真菌劑等[4-5],有研究表明,香灰菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物中含有桉油精,能顯著抑制番茄上尖孢鐮刀菌的生長[6],在果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的保藏中具有一定的應(yīng)用價值。

為了構(gòu)建香灰菌的轉(zhuǎn)化體系,研究香灰菌的基因功能,需要獲得高活性的啟動子元件。3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GPD)是糖酵解和糖異生途徑中的關(guān)鍵酶,其mRNA占酵母中poly(A)+RNA的2%～5%,表明gpd基因受高活性啟動子調(diào)控[7-8]。gpd啟動子是一個組成型表達的強啟動子,不依賴外界環(huán)境誘導(dǎo),可持續(xù)驅(qū)動下游基因的表達[9],研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源啟動子能顯著提高真菌的轉(zhuǎn)化效率[10-11],所以許多研究都從各自的材料中分離啟動子。目前,gpd啟動子已相繼從不同的擔子菌如糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)[11]、裂褶菌(Schizophyllumcommune)[12]、草菇(Volvariellavolvacea)[13]、金針菇(Flammulinavelutipes)[14]和子囊菌如構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[15]、沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)[16]、玉米絲軸黑粉菌(Sporisoriumreilianumf. sp.zeae)[17]、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)[18]、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[19]等真菌中成功分離,但是目前還沒有從香灰菌中克隆到gpd啟動子的報道。

本實驗通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)獲得香灰菌gpd上游序列,利用生物信息學(xué)分析及實驗驗證其啟動子的功能,這將為后續(xù)香灰菌基因功能的研究和外源蛋白的表達奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香灰菌(Hypoxylonsp.) 分離自福建三明真菌所提供的銀耳香灰混合菌種；pCAMBIA1302-pgpd-egfp-hph質(zhì)粒 改造自載體pCAMBIA1302,載體T-DNA所含的hph基因和egfp基因由糙皮側(cè)耳gpd啟動子驅(qū)動，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室構(gòu)建[20];大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)、TaqDNA polymerase、dNTPs、Trans2K plus II DNA Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶、pMD18-T克隆載體及Solution I、DNA Ligation Mix、cDNA合成試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 大連TaKaRa;凝膠純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒 美國Axygen;PDA及PDB培養(yǎng)基 美國Difco；YEB培養(yǎng)基、50×TAE電泳緩沖液 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、頭孢噻肟霉素(Cefo)、利福平(Rif)、乙酰丁香酮(AS) 美國Sigma-Aldrich;潮霉素B(Hyg B) 上海翊圣生物科技有限公司;誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)及共培養(yǎng)培養(yǎng)基(Co-CM)配制方法:0.8 mL 1.25 mol/L K-Buffer(pH 4.8)、20 mL MN-Buffer、1 mL 1% CaCl2·2H2O(w/v)、10 mL 0.01% FeSO4(w/v)、2.5 mL 20% NH4NO3(w/v)、10 mL 50%甘油(v/v)、5 mL trace elements(100 mg/L ZnSO4·7H2O、100 mg/L CuSO4·5H2O、100 mg/L H3BO3、100 mg/L Na2MoO4·2H2O)、40 mL 1 mol/L 2-N嗎啉代乙磺酸(MES)(pH 5.5)、20% 葡萄糖(w/v)(IM中10 mL,Co-CM中則為5 mL),用H2O補齊至1000 mL;MES 美國Amresco；其余試劑 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

T100TMThermal Cycler PCR儀、Gene Pluser XcellTM電穿孔系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;DU2640型核酸分析儀 美國Beckman Coulter;Eclipse80i正置熒光顯微鏡 日本Nikon;Gel Logical 200凝膠成像系統(tǒng) 美國Kodak;Centrifuge 5415R冷凍高速離心機 德國Eppendorf;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA和總RNA的提取 用無菌接種針從PDA斜面培養(yǎng)基中挑取香灰菌絲,接種于PDA培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)5 d,活化菌種。將活化好的菌絲接種于貼有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)7 d,用于DNA及RNA的提取。香灰菌基因組DNA提取采用改進的CTAB法[20],總RNA的提取采用改進的Trizol法[21],用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測DNA及RNA樣品的完整性,用DU2640型核酸分析儀分別檢測DNA及RNA樣品的濃度及純度,并保存于-80 ℃冰箱中,用于后續(xù)操作。

1.2.2 菌株gpd啟動子重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.2.1gpd基因片段及其啟動子的克隆 根據(jù)JGI數(shù)據(jù)庫(https://genome.jgi.doe.gov/portal/)中的香灰菌(Hypoxylonsp. CO27)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因序列[4],分析gpd基因序列的同源性,根據(jù)gpd基因序列保守區(qū)域,利用Primer 5.0軟件分別設(shè)計引物序列H1-gpd-F(5′-CGTCTTCCGCAATGCTGTT-3′)和H1-gpd-R(5′-CGAAGTTCTTGTTCAGGGAGA-3′)。根據(jù)試劑盒要求將RNA稀釋至適宜濃度后,第一鏈cDNA的合成采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)試劑盒,操作參照試劑盒說明書。以香灰菌cDNA為模板擴增gpd基因片段,PCR體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.8 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、模板1 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、ddH2O 14 μL(以下PCR體系均參照本體系)。PCR擴增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,60 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離目的條帶,切膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體于16 ℃連接2 h后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中,100 μg/mL氨芐青霉素抗性篩選及菌落PCR驗證,選擇陽性克隆子送天一輝遠公司(武漢)進行測序。

將已經(jīng)克隆得到的序列與JGI數(shù)據(jù)庫進行比對分析,選擇同源性最高的序列為模板,設(shè)計引物promoter-F(5′-GAACCCGTTTGACATTCGTG-3′)與引物H1-gpd-R擴增gpd基因片段及其上游部分,以香灰菌DNA為模版進行PCR擴增,PCR體系同上,PCR擴增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存,后續(xù)步驟同上,得到gpd啟動子與基因連續(xù)的片段。

1.2.2.2gpd啟動子區(qū)域的分析gpd啟動子借助Neural Network Promoter Prediction(http://www. fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)軟件、Signal Scan Search Request(https://www.arduino.cc/en/Tutorial/GSMToolsGsm ScanNetworks)、PLANTCAREA database(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ html/)AliBaba2.1(http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html?)及NCBI Blast(https: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行預(yù)測分析。

1.2.3 香灰菌gpd啟動子功能驗證

1.2.3.1 香灰菌gpd啟動子表達載體構(gòu)建 通過DNAMAN V6軟件分析克隆得到的香灰菌gpd啟動子的序列及初始載體pCAMBIA1302-pgpd-egfp-hph序列發(fā)現(xiàn),香灰菌gpd啟動子不含有EcoR I和BamH I位點,但是初始載體含有兩個BamH I酶切位點,不可以使用EcoR I和BamH I雙酶切直接將pgpd啟動子替換,所以選擇位于hph片段下游的酶切位點XhoI,分步克隆帶有酶切位點的香灰菌hgpd啟動子及egfp-hph片段。將設(shè)計帶有酶切位點EcoR I和BamH I的特異引物H-EcoR I-F(5′-GGAATTCGATGTCTGCTCGCCTCG-3′)H-BamH I-R(5′-GGGATCCGATGCCAACCTTGACGA-3′)(橫線處為酶切位點),用PCR法擴增得到帶有EcoR I和BamH I酶切位點的香灰菌gpd啟動子片段。用引物BamH I-egfp-F(5′-CGGATCCTGAGCAAGGGCGAG-3′)和XhoI-hph-R(5′-CCTCGAGCGGCTATTCCTTT GCCCTCG-3′)(橫線處為酶切位點)擴增帶有BamH I和XhoI酶切位點的egfp和hph片段,PCR體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.8 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、模板1 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、ddH2O 14 μL。PCR擴增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,65 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。分別酶切g(shù)pd片段、egfp-hph片段,抽提本實驗室已有的pCAMBIA1302-pgpd-egfp-hph質(zhì)粒,用EcoR I和XhoI雙酶切,與帶有酶切位點的gpd啟動子和egfp-hph片段,瓊脂糖凝膠電泳檢測各片段的相對濃度,按一定的比例用DNA Ligation Mix在16 ℃條件下連接12 h,構(gòu)建表達載體pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph,載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph載體圖Fig.1 pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph vector map

1.2.3.2 根癌農(nóng)桿菌的電擊轉(zhuǎn)化 提取表達載體pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph質(zhì)粒,在無菌條件下將0.1～0.5 μg純化的質(zhì)粒加入根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中,將混合液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯(電極間距1 mm)中,并置于電脈沖儀電極之間,在2.5 kV 25 mF 200 ohms條件下電擊5 ms,取出電擊杯,加入1 mL無抗的YEB培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,28 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)約3～4 h,然后涂布于50 μg/mL利福平和50 μg/mL卡那霉素的YEB抗性平板,28 ℃培養(yǎng)2 d,利用菌落PCR方法篩選根癌農(nóng)桿菌,使用H-EcoR I-F、XhoI-hph-R引物,以根癌農(nóng)桿菌單菌落為模板,以抽提出的pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph質(zhì)粒為陽性對照,PCR體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.8 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、模板1 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、ddH2O 14 μL,PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸3 min,30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香灰菌絲的轉(zhuǎn)化 生長于PDA平板上的香灰菌絲體在25 ℃條件下培養(yǎng)5 d后,用直徑6 mm打孔器均勻打取平板邊緣的菌絲塊,分別接種于含有潮霉素濃度50、100、110、120、130、140、150 μg/mL和含有頭孢噻肟霉素濃度為200 μg/mL的PDA選擇平板的中央,25 ℃避光培養(yǎng),觀察菌絲的生長狀況。

將香灰菌絲在PDB液體培養(yǎng)基中活化5 d,含有重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌在含有50 μg/mL利福平和50 μg/mL卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中活化,用含有200 μg/mL乙酰丁香酮的誘導(dǎo)培養(yǎng)IM[22]培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌,誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌毒性,當OD600達到0.4～0.6時,用根癌農(nóng)桿菌與磨碎的菌絲碎片等體積混合,然后將混合物涂布在附有微孔濾膜(0.45 μm,60 mm)的Co-CM固體培養(yǎng)基上(含200 μg/mL乙酰丁香酮)[23]。然后將根癌農(nóng)桿菌與菌絲體共培養(yǎng),25 ℃條件下培養(yǎng)3 d后,將菌絲體轉(zhuǎn)移至含有150 μg/mL潮霉素和200 μg/mL頭孢噻肟霉素的選擇性平板上25 ℃培養(yǎng)7～10 d,待轉(zhuǎn)化子萌發(fā)。

1.2.3.4 擬轉(zhuǎn)化子的篩選和驗證 將選擇性平板上長出的菌絲體轉(zhuǎn)接至新的選擇培養(yǎng)基上,在潮霉素抗性選擇的壓力下部分菌絲生長較快,將生長較快的菌絲接種到新的選擇性平板上,仍然快速生長的菌絲接種至貼有玻璃紙的無抗PDA平板上生長,再次轉(zhuǎn)接至選擇平板仍能生長的菌絲即為具有穩(wěn)定潮霉素抗性的擬轉(zhuǎn)化子。將篩選出的擬轉(zhuǎn)化子接種到貼有玻璃紙的無抗PDA平板上,用CTAB法提取擬轉(zhuǎn)化子的基因組DNA,對擬轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證,以DNA為模板用hph-F(5′-CTCGTGCTTT CAGCTTCGATGTAGG-3′)和hph-R(5′-CGGTTT CCACTAT CGGCGAGTACTT-3′)為引物進行PCR擴增,PCR體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs 0.8 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、模板1 μL、TaqDNA polymerase 0.2 μL、ddH2O 14 μL,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性30 s,65 ℃復(fù)性30 s;72 ℃延伸1 min,30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3.5 熒光蛋白在香灰菌轉(zhuǎn)化子中的表達 隨機選取兩株轉(zhuǎn)化子,挑取這些轉(zhuǎn)基因菌株的菌絲接種于含有潮霉素(150 μg/mL)的抗性平板上,在菌落旁插入無菌蓋玻片使菌絲爬片生長,待菌絲覆蓋蓋玻片一半面積時,小心取出蓋玻片,菌絲覆蓋面朝下將蓋玻片壓在載玻片上。做好標記后,使用熒光顯微鏡,選擇B-2A型濾鏡通過藍光激發(fā),分別在10×、20×物鏡下觀察菌絲細胞中綠色熒光蛋白表達情況。用隨機軟件NIS-Elements BR3.0(Nikon,Japan)進行標注分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香灰菌gpd啟動子的克隆

香灰菌絲總DNA和RNA的電泳膠圖如圖2所示,條帶表明DNA和RNA都比較完整,無明顯降解,符合PCR擴增要求。gpd基因部分片段cDNA和DNA序列擴增結(jié)果如圖3A所示,

圖2 香灰菌總RNA與DNAFig.2 Total RNA and DNA of Hypoxylon sp.注:M:Trans 2K DNA Marker; 泳道1為RNA,泳道2為DNA。

條帶大小符合預(yù)期且無雜帶。測序結(jié)果顯示,cDNA模板擴增出873 bp片段,DNA模板擴增出933 bp片段,基因片段中有一個60 bp的內(nèi)含子區(qū)域。然后將序列與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)Blastx比對,經(jīng)分析該序列與Nodulisporiumsp. 65-12-7-1(KY977747.1)同源性達94%,內(nèi)含子所在位置也相近,表明已經(jīng)獲gpd基因片段。根據(jù)同源性最高的序列為模板,設(shè)計引物,擴增gpd啟動子與基因連續(xù)的片段,得到一條1589 bp的序列,如圖3B所示。

圖3 gpd基因部分片段及其啟動子片段擴增產(chǎn)物Fig.3 Partial fragment of gpd gene and its promoter fragment amplification product

2.2 香灰菌gpd啟動子序列分析

gpd基因的上游側(cè)翼序列經(jīng)Neural Network Promoter Prediction軟件和Signal Scan Search Request軟件進行預(yù)測分析,結(jié)果顯示,gpd啟動子功能序列分布于克隆的gpd片段的上游1000 bp區(qū)域內(nèi),啟動子包含一個高分值起始轉(zhuǎn)錄位點,Neural Network Promoter Prediction軟件預(yù)測在ATG上游23 bp處有一個分值高達0.99分的預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點,PLANTCAREA database軟件分析該啟動子包含完整的CAAT-box、GATA-box、TATA-box、GC-box等核心元件及一些順式作用元件如A-box、NIT2 motif等。在啟動子核心元件的遠上游區(qū)域有兩個典型的CAAT-box,如圖4所示,該結(jié)構(gòu)與糙皮側(cè)耳[24]和草菇[25]gpd啟動子CAAT-box所處位置類似。AliBaba 2.1軟件分析出該啟動子序列含有許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,例如,HSF motif熱調(diào)控元件,GATA-box增強子,TCT-motif、L-box和SP1光響應(yīng)元件等順式作用元件。

2.3 香灰菌gpd啟動子功能的驗證

2.3.1 表達載體的構(gòu)建 瓊脂糖凝膠檢測各片段的相對亮度結(jié)果如圖5A所示,pCAMBIA1302-pgpd-egfp-hph載體骨架濃度比gpd啟動子片段和egfp-hph片段低,所以將連接體系設(shè)置為5 μL DNA Ligation Mix、2 μL pCAMBIA1302-pgpd-egfp-hph載體骨架、1.5 μLgpd啟動子片段和1.5 μLegfp-hph片段,連接后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,菌落PCR用H-EcoR I-F和XhoI-hph-R驗證,擴增出2700 bp條帶,與預(yù)期大小相符,表明融合表達載體pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph構(gòu)建成功。如圖5B所示,電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101,涂布于50 μg/mL利福平和50 μg/mL卡那霉素的YEB抗性平板,菌落PCR結(jié)果與質(zhì)粒陽性對照一致,表明轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌成功。

圖5 pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph載體構(gòu)建過程Fig.5 pCAMBIA1302-hgpd-egfp-hph plasmid construction process

2.3.2 擬轉(zhuǎn)化子的篩選及驗證 將野生型菌株在25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng),觀察菌絲的生長狀況,在140 μg/mL的潮霉素選擇性平板上仍能緩慢生長,150 μg/mL潮霉素選擇性平板上不生長,所以選擇150 μg/mL作為轉(zhuǎn)化子篩選的抗性濃度。而在200 μg/mL頭孢噻肟霉素選擇性平板上生長狀況與無抗生素平板一致,表明頭孢噻肟霉素對香灰菌生長不影響,可以用于轉(zhuǎn)化子篩選時抑制根癌農(nóng)桿菌的生長。

香灰菌絲經(jīng)根癌農(nóng)桿菌侵染后,在潮霉素抗性選擇的壓力下部分菌絲生長較快,其余呈現(xiàn)死亡狀態(tài),篩選三代后仍然有生長較好的菌絲,初步說明菌絲被轉(zhuǎn)化成功。隨機挑選擬轉(zhuǎn)化子,提取DNA作為模板擴增hph基因,并用野生型作為陰性對照,質(zhì)粒作為陽性對照,結(jié)果如圖6所示,在840 bp位置得到特異性條帶,表明菌絲體內(nèi)存在外源hph基因。

圖6 轉(zhuǎn)化子PCR的檢測結(jié)果Fig.6 PCR detection results of transformants

隨機挑取兩株轉(zhuǎn)化子爬片生長好的菌絲制好片后,用熒光顯微鏡觀察,從圖7中可以看出熒光顯微鏡中能觀察到明顯的綠色熒光,香灰菌gpd啟動子能有效驅(qū)動egfp的表達,同時也表明根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的香灰菌絲轉(zhuǎn)化成功。

圖7 不同轉(zhuǎn)化子菌株中綠色熒光蛋白表達檢測結(jié)果Fig.7 Detection results of green fluorescent protein expression in different transformant strains注:a1:明場中的野生型菌株;a2:熒光下的野生型菌株;b1、c1為隨機挑選的 兩株轉(zhuǎn)化子菌株在明場中的照片,b2、c2為轉(zhuǎn)化子菌株在熒光下的照片。

3 結(jié)論

本試驗利用PCR技術(shù)克隆得到香灰菌gpd基因上游1000 bp的DNA片段,通過生物信息學(xué)分析,該片段具有典型的啟動子特征,序列中除了包含一個高分值的轉(zhuǎn)錄起始位點,也含有增強子CAAT-box、核心啟動元件TATA-box,在核心元件TATA-box與轉(zhuǎn)錄起始位點之間有一個對驅(qū)動效率有重要影響的富含CT的區(qū)域。此外,還含有G-box、GC-box、HSF motif、L-box、SP1等順式作用元件。進一步將該片段與潮霉素抗性基因和綠色熒光蛋白基因連接構(gòu)建表達載體,再利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化香灰菌,結(jié)果顯示,該片段能夠驅(qū)動潮霉素抗性基因和綠色熒光蛋白基因在香灰菌中穩(wěn)定表達,說明所得片段的確為香灰菌的gpd啟動子,該啟動子能夠用于今后香灰菌基因表達及基因功能的研究。