彭鐮心,楊 雯,魏麗娟,,姚鎮(zhèn)東,,陳楊潔,趙 鋼

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,四川成都 611130; 3.成都大學(xué),農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610106)

蕎麥屬蓼科,主要栽培種有甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn),為一年生栽培植物。甜蕎分布廣闊,在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江以北的各省區(qū),常年栽培品種有150多個(gè)[1-3];甜蕎含有豐富的蛋白質(zhì)、均衡的氨基酸以及酚酸類、黃酮類、糖醇類等酚類成分,具有抗氧化、降血壓、降低毛細(xì)血管脆性等方面的藥理功效[4-6]。

萌發(fā)的甜蕎具有更高質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng),酚類成分顯著增高[10-12],甜蕎芽酚類成分主要是黃酮類成分,有抗氧化、抗菌、抗病毒等功能[13-14],因此是功能食品開發(fā)的重要新型原料。然而,目前甜蕎芽主要通過檢測(cè)蘆丁成分含量進(jìn)行質(zhì)量控制[15-16],專屬性不強(qiáng);同時(shí)不同品種、不同發(fā)芽時(shí)間甜蕎芽中酚類成分的積累規(guī)律不明確,不利于甜蕎芽的開發(fā)利用。

針對(duì)此問題,本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜對(duì)不同流速、波長(zhǎng)、流動(dòng)相進(jìn)行了考察,進(jìn)行5種酚類成分(葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁)的方法學(xué)考察,建立了甜蕎芽中5種酚類成分的同時(shí)測(cè)定方法;采用高效液相色譜法測(cè)定了甜蕎芽中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量,以此評(píng)價(jià)甜蕎芽質(zhì)量。最后,比較7種甜蕎芽的2個(gè)采收階段(第7、10 d)品種之間含量的差異,以期為甜蕎芽營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究和質(zhì)量控制提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

寧蕎1號(hào)、品甜2號(hào)、紅花甜蕎、赤甜1號(hào)、定甜3號(hào)、豐甜1號(hào)、寧甜1號(hào) 農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都大學(xué)),產(chǎn)地為四川省成都市金堂縣,采收期為2018年6月;葒草素對(duì)照品(批號(hào):waq-16041301)、異葒草素對(duì)照品(批號(hào):wak-16080404)、牡荊素對(duì)照品(批號(hào):130522),異牡荊素對(duì)照品(批號(hào):wak-16082004)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào):wak-16031602) 純度均大于98%,四川維克奇生物科技有限公司;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào):MUST-16070804)、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品(批號(hào):MUST-20161115) 純度均大于98%,成都曼斯特生物科技有限公司;甲醇 色譜純,安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?冰乙酸 色譜純,成都市科龍化工試劑廠;甲酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;水 重蒸餾水;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(QSM四元泵、SM-FTN進(jìn)樣器、CH-A柱溫箱、PDA檢測(cè)器) 沃特世上海科技有限公司;高效液相色譜儀(SPD-20A檢測(cè)器、DGU-20A5R脫氣機(jī)、SIL-20A進(jìn)樣器、LC-20AT輸送單元) 日本島津儀器公司;FD-2真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有點(diǎn)公司;DFT-100型手提式高速粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;CP224C十萬分之一電子分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;0SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DW-HL218型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司;H2050R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;GL-88B旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜蕎芽的制備 挑選顆粒飽滿、大小均一甜蕎粒,清洗、除雜、于純凈水中浸泡24 h(料液比約為1∶3),將浸泡好的甜蕎粒置于鋪有營(yíng)養(yǎng)土的育苗盤中,在溫度25 ℃、濕度80%的人工氣候箱中黑暗放置7 d,再放置于相同溫度、濕度和每天光照12 h的條件下培養(yǎng)3 d,定時(shí)噴水,分別于第7、10 d采收;采用真空冷凍干燥機(jī)對(duì)甜蕎芽進(jìn)行干燥,粉碎過80目篩,避光冷藏備用[17]。

1.2.2 酚類的提取及測(cè)定

1.2.2.1 酚類成分對(duì)照品的制備 分別精密稱定對(duì)照品葒草素0.00770 g、異葒草素0.00132 g、牡荊素0.00898 g、異牡荊素0.00810 g、蘆丁0.00720 g,分別置于10 mL棕色容量瓶中,加無水甲醇溶解并定容至10 mL,制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,其濃度分別為葒草素770.00 μg/mL、異葒草素132.00 μg/mL、牡荊素898.00 μg/mL、異牡荊素810.00 μg/mL、蘆丁720.00 μg/mL。分別取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量置于10 mL棕色容量瓶,加無水甲醇定容至10 mL,制成葒草素38.50 μg/mL、異葒草素26.40 μg/mL、牡荊素44.90 μg/mL、異牡荊素40.50 μg/mL、蘆丁36.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于4 ℃保存,備用。

1.2.2.2 甜蕎芽粉中多酚成分的提取 精密稱定甜蕎芽粉0.100 g樣品于100 mL錐形瓶中,加95%甲醇水溶液20 mL,搖勻并稱重,60 ℃超聲處理30 min,取出冷卻至室溫,用95%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,12000 r/min離心15 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾,取過濾液,待測(cè)[18]。

1.2.2.3 甜蕎芽中多酚測(cè)定色譜條件 ACQUITYUPLC? BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.20%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脫:0～3 min,10%～26%A;3～5 min,26%～29%A;5～9.5 min,29%～38%A;9.5～13 min,38%～44%A;13～15 min,44%A;15～17 min,44%～10%A;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;柱溫為35 ℃;流速為0.20 mL/min;進(jìn)樣量1 μL[19]。

1.2.3 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷的提取和測(cè)定

1.2.3.1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷對(duì)照品的制備 精密稱定對(duì)照品矢車菊素-3-O-葡萄糖苷0.00390 g、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷0.00200 g分別置于10 mL棕色容量瓶中,加5%甲酸水溶液溶解并定容至10 mL,制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,其濃度分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷390.00 μg/mL、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷200.00 μg/mL。分別取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量置于10 mL棕色容量瓶,加5%甲酸水溶液定容至10 mL,制成含矢車菊素-3-O-葡萄糖苷39.00 μg/mL、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷20.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,于4 ℃保存,備用。

1.2.3.2 甜蕎芽中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷的提取 分別精密稱取甜蕎芽粉1.000 g于100 mL錐形瓶中,避光條件下添加5%甲酸水溶液25 mL,搖勻并稱重,60 ℃超聲處理30 min,取出冷卻至室溫,用95%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,漩渦振蕩5 min,12000 r/min(4 ℃)冷凍離心15 min,取上清液,0.45 μm微孔濾膜過濾,取過濾液,待測(cè)[20]。

1.2.3.3 甜蕎芽中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷測(cè)定色譜條件 Global-ODSC18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:A(水∶甲酸=95∶5,V/V),B(乙腈∶甲酸=95∶5,V/V);梯度洗脫:0～5 min,10%～13%B;5～7 min,13%～15%B;7～9 min,15%B;9～10 min,15%～10%B;10～20 min,10%B;檢測(cè)波長(zhǎng)為520 nm;柱溫為40 ℃;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL[20]。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量,置于10 mL容量瓶中,加95%甲醇水溶液定容至刻度,搖勻配成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3次,取平均值,以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),繪制葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各成分的回歸方程及線性范圍。

1.2.4.2 精密度考察 取葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對(duì)照品適量,按“1.2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法制備混標(biāo),按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值,以峰面積分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.4.3 重復(fù)性考察 取甜蕎芽粉末樣品(過80目篩)6份,按“1.2.3”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制備甜蕎芽提取液,按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值,以峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性考察 取甜蕎芽粉末樣品,按“1.2.3”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制備甜蕎芽提取液,精密吸取同一樣品溶液,分別在0、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣1 μL,按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值,按峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.4.5 加樣回收率考察 取已知含量甜蕎芽樣品粉末,精密稱取樣品約1.00 g,共6份,分別加入葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對(duì)照品適量,按“1.2.3”項(xiàng)下供試品的制備方法制備提取液,按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的平均加樣回收率和RSD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,結(jié)果以平行測(cè)定所得的平均值表示,采用DPS 14.50配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚成分對(duì)照品和樣品色譜圖

預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)柱溫(33、35、37 ℃)、波長(zhǎng)(252、254、256 nm)、流速(0.15、0.20、0.25 mL/min)、流動(dòng)相等條件進(jìn)行了考察,結(jié)果表明最佳色譜條件如下:ACQUITYUPLC?BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.20%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脫:0～3 min,10%～26% A;3～5 min,26%～29% A;5～9.5 min,29%～38% A;9.5～13 min,38%～44% A;13～15 min,44% A;15～17 min,44%～10% A;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;柱溫為35 ℃;流速為0.20 mL/min;進(jìn)樣量1 μL。色譜條件經(jīng)過優(yōu)化后,多酚混合對(duì)照品溶液色譜圖(A)和樣品色譜圖(B)如圖1所示。由圖1可知,甜蕎芽中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁5種酚類成分的分離良好,出峰時(shí)間分別為:6.535、6.772、7.438、8.234、8.660 min。

圖1 多酚混合對(duì)照品溶液色譜圖(A)和樣品色譜圖(B)Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard solution(A)and control sample(B)注:1.葒草素;2.異葒草素;3.牡荊素;4.異牡荊素;5.蘆丁。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果 通過線性回歸分析,得到各成分的回歸方程式和線性范圍,如表1。結(jié)果表明,葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁分別在77.00～770.00、13.20～132.00、89.80～898.00、81.00～810.00、72.00～720.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.999)。

表1 甜蕎芽中5種酚類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of five polyphenols components in buckwheat sprouts

2.2.2 重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度與回收率考察結(jié)果 葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、相對(duì)保留時(shí)間、加樣回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%,由此可知超高效液相儀的精密度良好,甜蕎芽酚類成分重復(fù)性良好,酚類成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定;5種酚類成分的回收率在95%～105%之間,說明甜蕎芽酚類成分的提取方法準(zhǔn)確可靠,結(jié)果見表2。

表2 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與回收率考查結(jié)果Table 2 Investigation results of precision,stability,reproducibility and recovery rate

2.3 甜蕎芽中酚類成分的含量

避光發(fā)芽第7、10 d,不同品種甜蕎芽中酚類成分含量測(cè)定結(jié)果分別如圖2、圖3所示,不同甜蕎芽品種間總酚含量測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖2 甜蕎芽第7d不同品種間酚類的比較Fig.2 Comparison of phenols on the 7th day in different buckwheat sprouts注:不同字母表示7種甜蕎芽品種之間 有顯著性差異(P<0.05),圖3、圖4同。

圖4 不同甜蕎芽品種間總酚含量的比較Fig.4 Comparison of total phenol content in different varieties of buckwheat sprouts

由圖2可知,避光發(fā)芽第7 d,7種甜蕎芽中的4種酚類成分(葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁)品種之間具有明顯差異,含量最高的品種都是赤甜1號(hào),分別為8.03、3.18、23.28、5.28 mg/g,含量最低的品種都是寧蕎1號(hào),分別為3.91、1.46、10.95、2.14 mg/g;7種甜蕎芽中的異葒草素品種之間除了定甜3號(hào)和豐甜1號(hào)無顯著性差異外,其余品種皆有顯著性差異(P<0.05),其中含量最高的品種是赤甜1號(hào),3.89 mg/g,含量最低的品種是寧蕎1號(hào),1.99 mg/g;不同品種之間總酚(5種酚類成分的總和)也有顯著性差異(P<0.05)(如圖4),含量最高的是赤甜1號(hào),43.66 mg/g,含量最低的是寧蕎1號(hào),20.45 mg/g。

避光發(fā)芽第10 d,不同品種甜蕎芽中酚類成分含量測(cè)定結(jié)果如圖3,由圖3可知,除品甜2號(hào)和紅花甜蕎中的牡荊素和異牡荊素沒有顯著性差異外,其余品種之間各成分有顯著差異(P<0.05),5種酚類成分中含量最高的品種都是品甜2號(hào),分別為7.74、3.89、2.78、20.98、5.41 mg/g,含量最低的是定甜3號(hào),分別為2.96、1.47、0.98、7.16、1.56 mg/g;由圖4可知,總酚含量最高的是品甜2號(hào),為40.82 mg/g,最低的是定甜3號(hào),為14.13 mg/g。

2.4 不同品種矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷的含量

避光發(fā)芽第7、10 d,不同品種甜蕎芽中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量測(cè)定結(jié)果分別如圖5、圖6所示,不同甜蕎芽品種矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷總含量測(cè)定結(jié)果如圖7所示。

圖5 甜蕎芽第7d矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量的比較Fig.5 Comparison of content of cornulin-3-O-glucoside and cornarin-3-O-rutin on the 7th day in buckwheat sprouts

圖6 甜蕎芽第10d矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量的比較Fig.6 Comparison of content of cornulin-3-O-glucoside and cornarin-3-O-rutin on the 10th day in buckwheat sprouts

圖7 不同甜蕎芽品種間矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷總含量的比較Fig.7 Comparison of the content of total content of cornulin-3-O-glucoside and cornarin-3-O-rutin among different varieties of buckwheat sprouts

由圖5可知,避光發(fā)芽第7 d,7種甜蕎芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量都高于矢車菊素-3-O-蕓香糖苷,其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量最高的都是紅花甜蕎,分別為159.36、59.11 mg/kg,最低的是赤甜1號(hào),分別為39.41、10.50 mg/kg;由圖7可知,7種甜蕎芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷的總含量具有顯著差異(P<0.05),含量最高的是紅花甜蕎,218.47 mg/kg,最低的是赤甜1號(hào),為49.91 mg/kg。

由圖6可知,避光發(fā)芽第10 d,除寧甜1號(hào)和品甜2號(hào)沒有顯著性差異,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷2種酚類成分在其他品種之間皆有顯著性差異(P<0.05),其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量最高的是寧甜1號(hào),220.14 mg/kg,最低的是豐甜1號(hào),68.66 mg/kg;矢車菊素-3-O-蕓香糖苷含量最高的是紅花甜蕎,50.14 mg/kg,最低的是品甜2號(hào),19.61 mg/kg;由圖7可知,7種甜蕎芽中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷總含量具有顯著差異(P<0.05),其中含量最高的是寧甜1號(hào),282.95 mg/kg,最低的是豐甜1號(hào),88.35 mg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了甜蕎芽中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的超高效液相色譜檢測(cè)方法,考察了5種酚類成分的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度以及回收率,結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%,回收率分別為99.64%、98.68%、101.83%、98.61%、103.70%,在95%～105%范圍之內(nèi),表明甜蕎芽中5種酚類成分分離良好、各組分色譜峰的峰形對(duì)稱、儀器精密度良好。方法學(xué)考察表明,本文所建立的甜蕎芽5種酚類成分的超高效液相色譜測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠,可供甜蕎芽中5種酚類成分的快速準(zhǔn)確定量。通過測(cè)定7種甜蕎芽在第7、10 d酚類成分的含量可知,不同的品種之間酚類成分存在差異,其中第7 d甜蕎芽中5種酚類成分(葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁)總含量最高的品種是赤甜1號(hào),為43.66 mg/g，最低的品種是寧蕎1號(hào)，為20.45 mg/g;第10 d甜蕎芽中5種酚類成分總含量最高的品種是品甜2號(hào),為40.82 mg/g,最低的品種是定甜3號(hào)，為14.13 mg/g;第7和第10 d矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷總含量最高的分別是紅花甜蕎、寧甜1號(hào),為218.47、282.95 mg/kg,最低的分別是赤甜1號(hào)、豐甜1號(hào),為49.91、88.35 mg/kg。由此可見,不同的甜蕎芽品種之間各酚類成分的含量具有一定的差異,本結(jié)果可為甜蕎芽的選育提供參考。