孫 薈,蘭海靜,梁曉琳,黃聯(lián)莉,韋子龍,李全陽,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004; 2.廣西普生三鳳乳業(yè)有限公司,廣西南寧 530226)

益生菌在全球范圍內(nèi)已被人們廣泛接受,許多研究結(jié)果顯示,益生菌制品具有多種生理活性功能,如改善和維持正常的免疫系統(tǒng)[1]、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、增強(qiáng)粘膜屏障功能[2]及通過排斥腸道病原菌對腸上皮細(xì)胞的黏附從而減輕致病菌引發(fā)的感染等[3]。

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是人類腸胃道中的固有菌,我國于2003年[4]將羅伊氏乳桿菌批準(zhǔn)為可用于保健食品的益生菌菌種。Chau等[5]的研究表明,羅伊氏乳桿菌DMS 17938對嬰兒腸絞痛有明顯的改善作用;Savino等[6]在嬰兒的飲食中加入羅伊氏乳桿菌DMS 17938后,能夠通過減少病原體定植改善腸道健康。舒中玉等[7]通過灌胃小鼠菌液和上清液發(fā)現(xiàn),羅伊氏乳桿菌L0能夠顯著提高小鼠血液中IL-2和IFN-γ的含量,增強(qiáng)免疫力。但對于羅伊氏乳桿菌遺傳過程中的益生特性并未見報(bào)道。

廣西巴馬是中國著名的長壽之鄉(xiāng),郭飛翔[8]和王芳等[9]對巴馬長壽老人腸道菌群進(jìn)行研究,結(jié)果顯示巴馬長壽老人腸道益生菌的豐度顯著高于其他地區(qū)老人,甚至親緣性與青年人群接近;喻婷等[10-11]從巴馬長壽老人的糞便中篩選出益生特性良好的菌種,但未對其遺傳益生特性進(jìn)行研究。本研究將從百歲老人體內(nèi)篩選出的羅伊氏乳桿菌與廣西特色“奶中之王[12]”的水牛奶結(jié)合,探索該菌株在培養(yǎng)至300代過程中益生特性的穩(wěn)定性,進(jìn)一步利用其制備益生菌發(fā)酵水牛奶,以期為拓展該菌株在新型食品中的應(yīng)用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅伊氏乳桿菌LT018 由實(shí)驗(yàn)室自行篩選,-80 ℃保存;水牛奶 南寧市雄牛牧業(yè)有限公司;脫脂高蛋白奶粉 伊利食品有限責(zé)任公司;優(yōu)質(zhì)白砂糖 廣西東亞糖業(yè)有限公司;保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合冷凍干菌粉 丹麥DANISCO公司;蛋白糖 南昌市義和食品有限公司;MRS培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶(pepsin 1∶3000) Amresco公司;胰蛋白酶(Trypsin 1∶250) Amresco公司;牛膽汁(oxgall) Sigma公司。

HSS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;DNP-9082BS電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SW-CJ超凈工作臺(tái) 蘇凈安泰;DSX-280B高溫高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;JRJ300-D-I剪切乳化攪拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化 羅伊氏乳桿菌LT018經(jīng)TPY固體培養(yǎng)基連續(xù)活化傳代兩次,挑單菌落至液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株的連續(xù)培養(yǎng) 由前期實(shí)驗(yàn)[13]得出的生長曲線可知,羅伊氏乳桿菌LT018在12 h時(shí)處于生長對數(shù)期,因此選定12 h為一個(gè)培養(yǎng)周期。根據(jù)繁殖代數(shù)計(jì)算公式[14]得出,每經(jīng)過12 h繁殖代數(shù)約為5.8代。連續(xù)傳至300代。每隔50代取對數(shù)期菌種進(jìn)行活菌數(shù)測定、菌活力測定、對人工胃腸液耐受能力的測定和凝集性測定。

繁殖代數(shù)(代)=3.332(lgx2-lgx1)

式中:x1表示0 h時(shí)菌株的活菌數(shù),x2表示12 h時(shí)菌株的活菌數(shù)。

1.2.3 益生特性相關(guān)指標(biāo)的測定

1.2.3.1 活菌數(shù)測定 吸取1 mL對數(shù)期的活菌液,沿壁加入到含有9 mL的無菌生理鹽水中,充分振蕩搖勻。連續(xù)稀釋至合適的濃度,取100 μL稀釋菌液進(jìn)行涂布,37 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù)。

1.2.3.2 菌活力測定 連續(xù)培養(yǎng),每傳代至50、100、150、200、250代和300代對數(shù)期時(shí),收集各時(shí)期的菌液30 mL,4000 r/min 10 min離心收集菌體,加入10 mL的滅菌脫脂乳,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,量取10 mL樣品置于250 mL錐形瓶中,加入20 mL蒸餾水,滴入兩滴酚酞指示劑,以0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,記錄消耗的NaOH的量,參考國家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度檢測,根據(jù)公式[15]計(jì)算。

式中:C表示NaOH溶液濃度(mol/mL);V表示滴定NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液所消耗的量(mL);m表示試樣的質(zhì)量(g)。

1.2.3.3 對人工胃、腸液耐受能力的檢測 參照朱振軍[11]模擬胃液和模擬腸液的配方,每傳至50、100、150、200、250、300代對數(shù)期,移液槍吸取1 mL菌液加入到模擬胃液中,37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h,適當(dāng)稀釋后進(jìn)行涂布計(jì)數(shù)。同時(shí)吸取1 mL菌液胃液混合液加入到模擬腸液中進(jìn)行37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,稀釋到合適的濃度進(jìn)行涂布計(jì)數(shù),同時(shí)根據(jù)公式計(jì)算活菌存活率,以活菌存活率作為胃腸液耐受能力的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

式中:N0-0 h活菌數(shù);N1-經(jīng)模擬胃液消化3 h后的活菌數(shù);N2-經(jīng)模擬腸液消化24 h后的活菌數(shù)。

1.2.3.4 菌株的凝集性檢測 連續(xù)培養(yǎng),每傳至50、100、150、200、250代和300代對數(shù)期時(shí),取10 mL菌液置于無菌離心管中4000 r/min離心20 min以收集菌體,使用無菌PBS緩沖溶液洗滌后重新懸浮,再用無菌PBS緩沖溶液調(diào)節(jié)使其OD600值達(dá)到0.8,取5 mL重懸液,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2 h,取上懸浮液(不搖晃)測定其在600 nm處吸光度,并根據(jù)公式計(jì)算自凝集率A(%)。

式中:Ai-原始懸浮液OD值;Af-2 h后上懸浮液OD值。

1.2.4 羅伊氏乳桿菌發(fā)酵水牛乳工藝流程

發(fā)酵劑的制備:將培養(yǎng)至對數(shù)期的羅伊氏乳桿菌LT018液體培養(yǎng)基4000 r/min離心10 min收集菌體,以1%的接種量加入到滅菌的水牛奶中,41 ℃培養(yǎng)直至凝固,備用。按照說明書的比例:1.5 g菌粉發(fā)酵100 kg水牛奶,取適量菌粉加入水牛奶中,37 ℃培養(yǎng)至凝固,配制保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑。

預(yù)熱、均質(zhì):在新鮮水牛乳中加入蛋白糖(添加量為每1 kg牛奶中加入0.8 g蛋白糖),按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加白砂糖,在45 ℃下預(yù)熱后,進(jìn)行均質(zhì)。

殺菌、接種:采用巴氏殺菌法對牛乳進(jìn)行殺菌處理,條件為:95 ℃殺菌5 min。冷卻至40～42 ℃后,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)發(fā)酵劑比例進(jìn)行接種。

發(fā)酵、后熟:在不同的溫度下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵至80 °T后停止,在4 ℃下后熟24 h。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 控制溫度在39 ℃,白砂糖添加量為3%,改變菌種比例(羅伊氏乳桿菌發(fā)酵劑:普通發(fā)酵劑為1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)對發(fā)酵乳的影響;控制菌種比例為2∶1,溫度在39 ℃,改變白砂糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%)對發(fā)酵乳的影響;控制白砂糖添加量為3%,菌種比例為2∶1,改變溫度(37、38、39、40、41 ℃)。通過單因素實(shí)驗(yàn)考察各因素對發(fā)酵乳乳酸菌活菌數(shù)和感官品質(zhì)的影響,初步篩選出各因素中相對適合添加范圍。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 由單因素實(shí)驗(yàn)確定白砂糖添加量、溫度、發(fā)酵劑菌種比例對感官評(píng)定有顯著的影響,因此選定這三種因素為影響因素,以發(fā)酵乳感官評(píng)定作為響應(yīng)值,使用Design軟件設(shè)計(jì)了中心組合實(shí)驗(yàn)(CCD實(shí)驗(yàn)),如表1所示。利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法確定產(chǎn)品的最佳工藝參數(shù)。

表1 CCD試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of CCD experiment

1.2.7 發(fā)酵乳品質(zhì)指標(biāo)的測定

1.2.7.1 乳酸菌活菌數(shù)測定 參考國家標(biāo)準(zhǔn)中食品乳酸菌檢測辦法[16],利用平板計(jì)數(shù)法對發(fā)酵乳中羅伊氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行分別計(jì)數(shù),測定時(shí)間為發(fā)酵乳后熟24 h后[17]。

1.2.7.2 感官評(píng)定 選擇10名食品專業(yè)且經(jīng)過感官培訓(xùn)的人員,對發(fā)酵乳的色澤、滋味、氣味和組織狀態(tài)進(jìn)行描述,并對其進(jìn)行打分。感官評(píng)分如表2,具體標(biāo)準(zhǔn)參考國標(biāo)[18]。以感官評(píng)分結(jié)果作為最終響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的評(píng)定結(jié)果。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standard

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其中P<0.05表示兩組間數(shù)值差異顯著,P<0.01表示兩組間數(shù)值差異極顯著。使用Graph Pad Prism 7.00對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)傳代過程中活菌數(shù)的變化

如圖1所示,羅伊氏乳桿菌LT018在傳至300代的過程中,活菌數(shù)的變化呈先上升后下降，然后趨于穩(wěn)定的趨勢。它在0代的活菌數(shù)較低,主要原因可能是長期處于低溫保存狀態(tài)下,菌株并未馬上完全適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境。在傳至100代時(shí),活菌數(shù)達(dá)到最高值,說明LT018在100代附近最為活躍。從100～300代的過程中,活菌數(shù)的趨勢是先下降后平緩,LT018是一株適應(yīng)能力強(qiáng)的菌株,在多次傳代過程中可能需要在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上額外添加營養(yǎng)成分,以此來滿足其生長所需原料。但在整個(gè)傳代過程中,羅伊氏乳桿菌LT018的活菌數(shù)一直處于8.89～9.40lg CFU/mL之間的范圍,有較高的活菌總數(shù),說明該菌株在遺傳過程中活性穩(wěn)定。

圖1 羅伊氏乳桿菌LT018傳代過程中活菌數(shù)變化Fig.1 Changes in viable counts during the passage of Lactobacillus reuteri LT018

2.2 連續(xù)傳代過程中菌活力的變化

乳酸菌的產(chǎn)酸能力是判斷其是否適用于食品發(fā)酵乳的重要指標(biāo)之一[19]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,第100代的產(chǎn)酸能力最強(qiáng),可能是由于其在對數(shù)期間活菌數(shù)最多;從總體趨勢來看,從0～300代,羅伊氏乳桿菌LT018的產(chǎn)酸能力比較穩(wěn)定,酸度保持在38.44～40.01 °T的范圍內(nèi),說明這株羅伊氏乳桿菌在傳代過程中,產(chǎn)酸能力始終保持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi),適合作為食品發(fā)酵乳的發(fā)酵劑使用[20]。

2.3 連續(xù)傳代過程中菌株對人工胃、腸液的耐受能力

攝入益生菌后,在腸道內(nèi)存活能力的高低是評(píng)價(jià)益生菌是否能發(fā)揮其作用的標(biāo)準(zhǔn)之一[21],因此,耐受模擬胃、腸液是評(píng)價(jià)一株益生菌功能性的重要指標(biāo)[22]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在連續(xù)培養(yǎng)300代的過程中,除第0代和其余代有明顯的差異外,羅伊氏乳桿菌LT018經(jīng)過模擬胃液的條件后,存活率均保持在在99%以上。李文靜等[23]在研究三株羅伊氏乳桿菌時(shí),發(fā)現(xiàn)這三株菌在模擬胃液中的存活率為82.22%～91.65%,相比而言,本實(shí)驗(yàn)使用的羅伊氏乳桿菌LT018在模擬胃液中的存活率遠(yuǎn)高于這三株菌,說明羅伊氏乳桿菌LT018對于胃液的耐受能力更強(qiáng)。有研究表明,益生菌要發(fā)揮其益生作用,需要在腸道內(nèi)的存活量達(dá)到106CFU/d[24],而羅伊氏乳桿菌LT018在0～300代過程中依然能夠保持高于106CFU/mL的活菌數(shù),表明羅伊氏乳桿菌能夠在腸道內(nèi)發(fā)揮其益生作用。

表3 羅伊氏乳桿菌LT018連續(xù)傳代過程中在模擬胃液和腸液中的活細(xì)胞計(jì)數(shù)(lg CFU/mL)和存活率(%)Table 3 Viable cell count(lg CFU/mL)and survival rate(%)in simulated gastric and intestinal fluids during continuous passage of L. reuteri LT018

表4 羅伊氏乳桿菌LT018連續(xù)傳代過程中的凝集率Table 4 The agglutination rate during continuous passage of L.reuteri LT018

2.4 連續(xù)傳代過程中菌株的凝集性變化

在腸道內(nèi),菌株的自凝集能力是決定其是否能黏附到腸上皮細(xì)胞的重要因素[25],它們通過競爭宿主-細(xì)胞基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)阻止病原體的黏附和擴(kuò)散[26]。羅伊氏乳桿菌LT018在0代時(shí)凝集率達(dá)到最高,為66.8%。在整個(gè)傳代過程中,50、100代之間的凝集率無顯著性差異(P>0.05),200～300代之間雖有顯著性差異(P<0.05),但整體凝集率始終保持在55.4%～66.8%的范圍內(nèi)。Klopper等[27]從成人糞便中篩選出幾種益生菌并對它測定了自凝集性,其中羅伊氏乳桿菌HFI-LD5的自凝集率在30.73%±6.17%。而羅伊氏乳桿菌LT018連續(xù)培養(yǎng)至300代的過程中,凝集率雖有上下波動(dòng)的趨勢,但始終有著較高的凝集性,均高于羅伊氏乳桿菌HFI-LD5的凝集率,以此說明羅伊氏乳桿菌LT018在傳代過程中保持較強(qiáng)的黏附腸上皮細(xì)胞的能力。

2.5 發(fā)酵乳單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 溫度對發(fā)酵乳的影響 溫度對發(fā)酵乳感官評(píng)分和益生菌數(shù)的影響如圖3所示。隨著溫度的升高,發(fā)酵乳的感官評(píng)分和益生菌活菌數(shù)逐漸的升高,在40 ℃時(shí),達(dá)到最高值,其中感官評(píng)定分?jǐn)?shù)為86.1,益生菌活菌數(shù)為1.021×108CFU/mL。在41 ℃時(shí)感官評(píng)分和益生菌數(shù)有所下降，主要原因是溫度升高有利于酶活的提高[28],使細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)不斷加速,生長速率加快[29]。發(fā)酵溫度越高,乳酸菌發(fā)酵的效果越好,產(chǎn)酸也越多[19],到達(dá)80 °T的時(shí)間就越短。但同時(shí),溫度過高會(huì)超過乳酸菌的最佳發(fā)酵溫度,會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳品質(zhì)下降[30]。圖3表明,溫度在39、40、41 ℃范圍內(nèi)發(fā)酵乳的感官評(píng)定值較高,同時(shí)益生菌數(shù)量也保持在較高的水平。

2.5.2 白砂糖添加量對發(fā)酵乳的影響 糖添加量對發(fā)酵乳感官評(píng)分和益生菌數(shù)的影響如圖4所示。在糖添加量為1%～3%時(shí),感官評(píng)分和益生菌活菌數(shù)都為上升的趨勢,添加量超過3%后,感官評(píng)分和活菌數(shù)呈相反的趨勢。白砂糖的添加量較低時(shí),發(fā)酵乳滋味偏酸;添加量為3%時(shí),感官評(píng)分最高;超過3%時(shí),由于白砂糖添加過量,影響感官評(píng)分。而對益生菌活菌數(shù)而言,白砂糖可以作為乳酸菌的生長因子,促進(jìn)乳酸菌的生長,所以呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢[31]。綜合分析選用添加量為2%、3%、4%進(jìn)行下一步響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 糖添加量對樣品感官評(píng)分和益生菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of sugar addition on the samples sensory score and probiotic count

2.5.3 菌種比例對發(fā)酵乳的影響 菌種比例對發(fā)酵乳感官評(píng)分和益生菌數(shù)的影響如圖5所示。當(dāng)菌種為1∶1～2∶1時(shí),感官評(píng)分持續(xù)上升;菌種比例超過2∶1后,感官評(píng)分有所下降。菌種比例直接影響到發(fā)酵乳的發(fā)酵程度[32]。普通發(fā)酵劑含量過高,則發(fā)酵乳發(fā)酵時(shí)間過快,發(fā)酵乳的持水力不好;益生菌發(fā)酵劑過高時(shí),會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酸能力不足,發(fā)酵乳的狀態(tài)不佳。由圖5可知,比例為1.5∶1、2∶1、2.5∶1時(shí),益生菌活菌數(shù)保持在較高的水平,同時(shí)感官效果較好。所以根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取菌種比例為:1.5∶1、2∶1、2.5∶1繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 菌種比例對樣品感官評(píng)分和益生菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of strain ratio on the samples sensory score and probiotic count

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出三個(gè)因素的最佳范圍,設(shè)計(jì)了CCD中心組合試驗(yàn)。利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法確定產(chǎn)品的最佳工藝參數(shù),如表5所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken test

對Design expert軟件對Box-Behnken試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次項(xiàng)擬合,得到的回歸方程為:

Y=85.70+1.27A+2.83B+0.75C-1.22AB-0.0058AC-0.88BC-6.07A2-11.90B2-5.66C2。

其中,Y為感官評(píng)定的預(yù)測響應(yīng)值,A為溫度,B為白砂糖添加量,C為菌種比例。表6為響應(yīng)面回歸方程的方差分析結(jié)果(感官評(píng)定)。

由表6可知,所建立的模型極顯著(P=0.0001<0.001),模型的失擬項(xiàng)不顯著(P=0.3041>0.05),說明建立模型在整個(gè)回歸區(qū)域內(nèi)擬合度較好,模型可信。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9983,校正系數(shù)R2adj=0.9960,說明預(yù)測值和試驗(yàn)值的相關(guān)性高,CV值(變異系數(shù))較低為0.69%,說明模型具有較高的精確度,結(jié)果可信。由系數(shù)顯著性可知,因子的一次項(xiàng)A(溫度)、B(白砂糖添加量)、C(發(fā)酵劑混合比例)及二次項(xiàng) A2、B2、C2對發(fā)酵乳口感均有極顯著影響。具體響應(yīng)曲面圖如圖6所示。

表6 RSM回歸方程方差分析(感官評(píng)分)Table 6 RSM regression equation analysis of variance(sensory score)

圖6 溫度、菌種比例、糖添加量對感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of temperature, strain ratio,and sugar addition on sensory score

由響應(yīng)面圖和等高線可以看出因素與因素的交互作用對響應(yīng)值的影響程度。如圖6所示,交互項(xiàng)AB和BC之間的等高線均呈橢圓形,說明對于發(fā)酵乳感官評(píng)分來說,溫度與糖添加量和糖添加量與菌種比例之間的交互作用顯著。由響應(yīng)面分析可知,回歸模型存在最大值。由回歸方程計(jì)算得到Y(jié)的最大估計(jì)值為85.70,此時(shí)溫度為40.00 ℃,糖添加量為3.00%,菌種比例為2∶1。

2.7 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件為:溫度40.00 ℃,糖添加量3.00%,菌種比例2∶1,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。最終感官評(píng)分為86.63±1.47,此時(shí)益生菌活菌數(shù)達(dá)到1.033×108CFU/mL,與響應(yīng)預(yù)測值擬合率為 98.92%,說明該響應(yīng)面優(yōu)化參數(shù)準(zhǔn)確,有一定的實(shí)際利用價(jià)值。

3 結(jié)論

羅伊氏乳桿菌LT018在傳至300代的過程中,其益生特性穩(wěn)定,在模擬的腸胃液環(huán)境中具有較高的存活性,菌株本身具有優(yōu)良的自聚合能力。羅伊氏乳桿菌LT018與保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌聯(lián)合發(fā)酵水牛乳的最佳工藝是:發(fā)酵溫度40.00 ℃,糖添加量3.00%,菌種比例2∶1時(shí),制品的感官評(píng)分為86.63,益生菌活菌數(shù)達(dá)到1.033×108CFU/mL。本研究對羅伊氏乳桿菌LT018的應(yīng)用提供了理論與技術(shù)依據(jù)。