陳 亮 余 佶 游湘淘 金旋鷺 丁家云 麻成金 姚茂君

(1. 吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2. 吉首大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，湖南 吉首 416000)

綠茶具有緩解動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防癌癥、抗炎抑菌、抗衰老等[1-4]功效，其抗氧化能力是體現(xiàn)其功效的重要指標(biāo)[5]。目前，普遍認(rèn)為的功效因子有茶多酚、氨基酸、黃酮等生物活性成分，可有效清除自由基，抑制活性氧的形成[6]，從而對(duì)涉及氧化應(yīng)激的病理起作用。在綠茶沖泡過(guò)程中，抗氧化物質(zhì)通過(guò)沖泡浸出而進(jìn)入茶湯，從而起抗氧化作用，而抗氧化物質(zhì)因組成、含量的不同，表現(xiàn)出的抗氧化性能也不同。Dra?enka等[7]發(fā)現(xiàn)綠茶中總酚類物質(zhì)的浸出量與沖泡溫度呈正相關(guān)，且茶湯的抗氧化能力與總酚類物質(zhì)的浸出量直接相關(guān)。Pérez-Burillo等[8]發(fā)現(xiàn)白茶多酚類物質(zhì)的浸出量隨沖泡時(shí)間和水溫的增加而增加，茶湯清除自由基的能力呈線性增長(zhǎng)，且在水溫98 ℃，沖泡時(shí)間7 min時(shí)，茶湯的感官品質(zhì)及清除自由基的能力較好。以上研究主要集中在不同沖泡條件對(duì)茶湯中滋味成分浸出量、感官品質(zhì)及抗氧化性能的影響，尚未見(jiàn)對(duì)綠茶(如黃金茶)中生物活性成分浸出規(guī)律及抗氧化性能的研究報(bào)道。

湘西黃金茶起源于湘西自治州保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村，是湖南省優(yōu)良的地方群體品種，也是湘西古老、特異、珍稀的地方茶樹品種資源[9]。湘西黃金茶以其高氨基酸含量(高達(dá)7.47%)[10]的特點(diǎn)，受國(guó)內(nèi)外廣大茶葉愛(ài)好者的青睞。試驗(yàn)擬以湘西黃金茶為研究對(duì)象，考察不同沖泡溫度、時(shí)間下茶多酚、游離氨基酸的浸出量，并建立浸出動(dòng)力學(xué)模型；采用ABTS法、DPPH法測(cè)定茶湯體外抗氧化性能，并探討不同沖泡溫度、時(shí)間對(duì)其抗氧化性能的影響。旨在深入了解湘西黃金茶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為湘西黃金茶深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

湘西黃金茶：湘西自治州保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村提供；

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品：江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；

L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

1,1-二苯基-2-三硝基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：阿拉丁試劑有限公司；

碳酸鈉、Folin-酚試劑、沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇、茚三酮等：分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)—分光光度計(jì)：UV-2450型，日本島津公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101T型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

電子天平：FA224型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)字恒溫水浴鍋：HH-2型，常州智博瑞儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶湯的制備 準(zhǔn)確稱取黃金茶8 g，迅速加入到1 600 mL 蒸餾水中，水溫分別為60，70，80，90 ℃，以一定轉(zhuǎn)速攪拌并保持恒溫。分別在1，2，3，4，5，10，15，20，25，30，40，50，60 min 時(shí)用無(wú)菌注射器吸取一定量的茶湯，經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，迅速放入4 ℃保存。

1.2.2 茶多酚含量的測(cè)定 采用何健等[11]方法并稍作修改。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配置10，20，30，40，50 μg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=3.761x+0.006 5，R2=0.997 5)。取1 mL茶湯樣品加入5.0 mL體積分?jǐn)?shù) 10% Folin-酚試劑，搖勻，反應(yīng)10 min，加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，于30 ℃水浴恒溫1 h，避光冷卻10 min，測(cè)定765 nm處吸光值，以沒(méi)食子酸當(dāng)量GAE表示(mg GAE/mL)。

1.2.3 游離氨基酸含量的測(cè)定 采用Yin等[12]方法并稍作修改。以谷氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配置40，60，80，100，120 μg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=2.394 2x-0.097 9，R2=0.997 1)。吸取茶湯樣品1 mL，分別加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0)，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，冷卻至室溫，蒸餾水定容至25 mL，避光反應(yīng)10 min，測(cè)定570 nm處吸光值，以谷氨酸當(dāng)量GLU表示(mg GLU/mL)。

1.2.4 黃金茶中生物活性成分浸出動(dòng)力學(xué)模型 茶湯中茶多酚、游離氨基酸等生物活性成分在沖泡過(guò)程中為典型的固-液相擴(kuò)散傳質(zhì)過(guò)程，滿足二階動(dòng)力學(xué)方程[13]，如式(1)所示。

(1)

式中：

k——二階浸出速率常數(shù)，mL/(mg·min)；

CT——t時(shí)刻茶湯中生物活性成分的濃度，mg/mL；

C∞——茶湯中生物活性成分的飽和濃度，mg/mL。

將式(1)線性變換并積分，代入邊界條件t=0～t，Ct=0～C，得：

(2)

將式(2)線性變換得：

(3)

由式(3)可知，二階浸出速率常數(shù)k由t/C、Ct、C∞決定，以t/C—t作回歸直線圖，由該直線的斜率與截距可求得飽和濃度C∞和二階速率常數(shù)k。

根據(jù)Arrhenius方程可知，浸出速率常數(shù)k與溫度T間的關(guān)系如式(4)所示。

(4)

式中：

A——前因子， mL/(mg·min)；

R——摩爾氣體常量，8.314 5 J/(mol·K)；

T——熱力學(xué)溫度，K；

Ea——活化能，J/mol。

根據(jù)Arrhenius方程，以lnk—1/T作圖可得Ea與A。

1.2.5 DPPH清除率的測(cè)定 參考郭虹雯等[14]方法并稍作修改。取0.1 mL茶湯樣品與無(wú)水乙醇稀釋后的DPPH 溶液3.9 mL混合均勻，室溫靜置30 min，測(cè)定517 nm 處吸光值。繪制沒(méi)食子酸工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1 070.8x+16.304，R2=0.992 2)，樣品的DPPH清除率用沒(méi)食子酸當(dāng)量GAE表示(mg GAE/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各試驗(yàn)處理均設(shè)3次重復(fù)。采用Excel 2016、SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用One-way ANOVA進(jìn)行多重比較分析，利用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沖泡條件對(duì)茶湯中茶多酚含量的影響

由圖1可知，同一沖泡時(shí)間下，茶多酚濃度隨沖泡溫度的升高逐漸增加，浸出速率也逐漸增大，0～1 min，60～90 ℃水溫下，茶多酚的浸出速率分別為0.029 3，0.035 2，0.059 2，0.084 7 mg GAE/(mL·min)；同一沖泡溫度下，黃金茶茶湯中茶多酚濃度與沖泡時(shí)間呈正相關(guān)，浸出速率與沖泡時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)水溫為90 ℃時(shí)，沖泡30 min后茶多酚濃度趨于穩(wěn)定，30～60 min內(nèi)茶多酚濃度無(wú)明顯變化，約為0.330 1 mg GAE/mL。一般來(lái)說(shuō)，沖泡水溫的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，有利于茶多酚的浸出，但隨著水溫不斷升高、沖泡時(shí)間不斷延長(zhǎng)，茶葉細(xì)胞破裂物質(zhì)浸出的同時(shí)，茶多酚的氧化聚合反應(yīng)也很劇烈，使茶多酚的浸出速率呈先增加后減小趨勢(shì)[16]。

圖1 沖泡溫度與時(shí)間對(duì)茶湯中茶多酚的影響

Figure 1 Effect of the brewing temperature and time on tea polyphenols from Xiangxi golden tea

方差分析結(jié)果(表1)顯示，沖泡時(shí)間與水溫對(duì)茶多酚浸出量的影響均極顯著(P<0.01)，依次為沖泡溫度>沖泡時(shí)間。

表1 茶多酚浸出量方差分析Table 1 Variance analysis of theamount of tea polyphenols

2.2 沖泡條件對(duì)茶湯中氨基酸含量的影響

由圖2可知，游離氨基酸的浸出趨勢(shì)與茶多酚類似。同一沖泡溫度下，一定時(shí)間內(nèi)，茶湯中游離氨基酸濃度隨沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，浸出速率逐漸減小，沖泡水溫為90 ℃時(shí)，0～1 min游離氨基酸浸出速率達(dá)0.092 1 mg GLU/(mL·min)，4～5 min游離氨基酸浸出速率為0.021 8 mg GLU/(mL·min)，25～30 min游離氨基酸浸出速率為0.001 4 mg GLU/(mL·min)，30 min 后游離氨基酸濃度趨于穩(wěn)定，30～60 min游離氨基酸浸出速率僅為0.000 7 mg GLU/(mL·min)。同一沖泡時(shí)間下，游離氨基酸濃度隨沖泡溫度的升高而增大，且溫度越高，氨基酸浸出速率越大。60～90 ℃水溫沖泡，0～1 min游離氨基酸浸出速率分別為0.092 1，0.060 5，0.048 9，0.041 8 mg GLU/(mL·min)。根據(jù)相似相溶原理，游離氨基酸易溶于水，隨沖泡溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)越活躍，越有利于游離氨基酸與水形成氫鍵，促使游離氨基酸浸出。

圖2 沖泡溫度與時(shí)間對(duì)茶湯中氨基酸的影響Figure 2 Effect of the brewing temperature and time on amino acid from Xiangxi golden tea

方差分析結(jié)果(表2)顯示，沖泡溫度與時(shí)間對(duì)茶湯中游離氨基酸浸出量的影響均極顯著(P<0.01)，依次為沖泡時(shí)間>沖泡溫度。

表2 游離氨基酸浸出量方差分析Table 2 Variance analysis of the amount of free amino acid

2.3 茶湯中抗氧化物質(zhì)浸出動(dòng)力學(xué)模型

由圖3可知，不同沖泡溫度下，沖泡時(shí)間與茶多酚、游離氨基酸濃度的比值(t/Ct)隨沖泡時(shí)間(t)的增大基本呈直線上升趨勢(shì)。各擬合曲線的相關(guān)系數(shù)均>0.99，線性關(guān)系良好，說(shuō)明黃金茶茶湯中茶多酚、游離氨基酸的浸出滿足二階動(dòng)力學(xué)方程，具體動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

圖3 不同沖泡溫度下茶湯生物活性成分濃度與沖泡時(shí)間的線性關(guān)系

Figure 3 Linearized plots of tea bioactive compounds concentrations on different brewing temperatures to time

表3 茶湯中生物活性成分浸出動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters for the extraction of chemical constituents from tea infusion

由表3可知，茶湯中茶多酚、游離氨基酸的飽和濃度(C∞)、二階釋放速率常數(shù)(k值)隨沖泡溫度的升高而增大。升高溫度，生物活性成分溶解度增加，從而導(dǎo)致物質(zhì)浸出率增大[17]。

2.4 沖泡條件對(duì)茶湯抗氧化性能的影響

由圖5可知，茶湯中DPPH、ABTS清除率在0～10 min 內(nèi)隨沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)與水溫的增加而不斷增加，沖泡10 min時(shí)，茶湯中DPPH、ABTS清除率隨沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢增加并逐漸趨于穩(wěn)定，此時(shí)不同沖泡溫度(60，70，80，90 ℃)茶湯的DPPH清除率分別為0.037 9，0.054 8，0.061 2，0.067 1 mg GAE/mL，ABTS清除率分別為0.103 3，0.123 2，0.142 2，0.151 4 mg GAE/mL。

圖4 溫度與浸出速率常數(shù)的關(guān)系Figure 4 Relationship between temperature and the dissolution rate constant

圖5 沖泡溫度與時(shí)間對(duì)黃金茶茶湯抗氧化性能的影響Figure 5 Effects of brewing temperature and time on antioxidant properties of tea infusion

沖泡溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，使茶多酚濃度逐漸增加，浸出速率也逐漸增大，從而導(dǎo)致茶湯的抗氧化活性逐漸增大[19]。但水溫過(guò)高、沖泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)多酚氧化現(xiàn)象，致使茶多酚浸出速率下降，對(duì)DPPH、ABTS清除速率下降。此外，茶湯的抗氧化能力還受VC、黃酮類化合物、游離氨基酸、茶多糖等生物活性成分的影響[20]。

3 結(jié)論

試驗(yàn)探究了沖泡條件對(duì)湘西黃金茶茶多酚、游離氨基酸浸出規(guī)律及對(duì)其抗氧化性能的影響。結(jié)果表明，黃金茶茶湯中茶多酚、游離氨基酸濃度與沖泡時(shí)間及水溫均顯著相關(guān)(P<0.01)，茶湯DPPH、ABTS清除率隨沖泡溫度的增加而增加，30 min后趨于穩(wěn)定。沖泡黃金茶茶湯中茶多酚、游離氨基酸的浸出滿足二階動(dòng)力學(xué)方程，且溫度與浸出速率常數(shù)k有良好的線性關(guān)系，游離氨基酸在茶湯中的浸出速率大于茶多酚。后續(xù)需進(jìn)一步探討不同沖泡條件對(duì)生物活性成分的浸出規(guī)律與黃金茶感官品質(zhì)、抗氧化能力之間的關(guān)系，闡明茶葉中生物活性成分的浸出規(guī)律，為黃金茶深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、消費(fèi)者科學(xué)飲茶提供理論參考。