耿立梅，閆紅倩，于向艷，馬璇雯，牛曉艷

(1. 河北省中醫(yī)院呼吸一科, 石家莊 050011； 2. 石家莊市中醫(yī)院呼吸科，石家莊 050000；3. 鄭州市管城中醫(yī)院內(nèi)科，鄭州 450000)

哮喘是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。研究證實(shí)，ICAM-1、IL-10以及IL-17在哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。ICAM-1參與呼吸道炎癥形成的早期階段，可介導(dǎo)白細(xì)胞在呼吸道黏膜的黏附和轉(zhuǎn)移；IL-10在炎癥早期可抑制促炎因子、 趨化因子的合成，阻斷炎癥細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子；IL-17是T 細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因素，對(duì)炎癥細(xì)胞有強(qiáng)大的化學(xué)趨化作用。 Treg/Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-10/IL-17比例失衡是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)。中醫(yī)的貼敷及穴注治療哮喘的療效也被研究所證實(shí)。本研究旨在探討穴注加貼敷對(duì)哮喘大鼠血清IL-10、IL-17和肺組織ICAM-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

雄性Wistar SPF級(jí)大鼠60只，體質(zhì)量(120±20) g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。將動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(A)、模型組(B)、貼敷組(C)、穴位注射組(D)和貼敷組+穴位注射組(E)各12只。

1.2 主要試劑和儀器

雞卵蛋白(Sigma),氫氧化鋁(分析純，成都科龍化工試劑廠),IL-10定量酶檢測(cè)試劑盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司), IL-17定量酶分析試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司)，免疫組化試劑盒：一抗：兔抗小鼠ICAM-1(北京博安生物科技有限公司)，二抗：山羊抗兔 IgG抗體-HRP多聚體(北京中山金橋生物技術(shù))，顯微圖像分析系統(tǒng)HMIAS-2000(武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué))，數(shù)碼顯微鏡 DP73(Olympus公司),草分枝桿菌 FU36 注射液1.72 μgml(成都金星健康藥業(yè)有限公司),貼敷(河北省中醫(yī)院呼吸科)。

1.3 造模方法

在第1天和第8天給予腹腔注射OVA和氫氧化鋁懸浮液1 mL[1-2]，并給予正常組注射相同量的生理鹽水。 在第15天將大鼠置于獨(dú)立的密封霧化箱中進(jìn)行霧化，并用2%OVA溶液進(jìn)行超聲霧化。 每天1次用生理鹽水替換正常組，每次30 min。 各組大鼠的行為發(fā)生了變化。 在霧化組中，有呼吸短促、咳嗽、煩躁、點(diǎn)頭，甚至四肢柔軟易發(fā)，尿失禁和大小便失禁。 挑戰(zhàn)持續(xù)7 d，然后每周2次。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

在成功建模后的第22天開始干預(yù)。 穴位大椎、雙頂川、雙肺、脾、雙腎服用。 剃須后，食欲組大鼠剃毛， 發(fā)表于6 h; 穴位注射組注射穴位結(jié)核，5組穴位輪流取穴，每穴5 μl; 在應(yīng)用組中應(yīng)用穴位，然后應(yīng)用中藥6 h，模型組用相同的治療組治療。 更換相同量的生理鹽水和空貼紙,每隔1 d操作1次，每次治療3次，共4個(gè)療程。

1.5 標(biāo)本采集

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml / 100 mg)麻醉，以仰臥位固定，并將動(dòng)脈血從右側(cè)腹股溝取出至血液收集管。 將管放置30 min，以3000 r/min離心并分配血清,收集放入冷凍管中，在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線，將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定，在-20℃冷凍備用; 將大鼠的胸腔暴露于胸中線，將右肺中葉置于10%甲醛溶液中固定。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 HE染色 右肺中葉常規(guī)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色。

1.6.2 ELISA檢測(cè) 酶標(biāo)儀采用HBS-1096C Pro自動(dòng)酶標(biāo)儀(上海珂淮儀器有限公司)，IL-10和IL-17的ELISA檢測(cè)試劑盒分別為北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。根據(jù)試劑盒說明書嚴(yán)格操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IL-10、IL-17水平。

1.6.3 免疫組化檢測(cè) 嚴(yán)格按照SABC免疫組化試劑盒說明操作：切片常規(guī)脫蠟脫水→3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶→滴加一抗(兔抗鼠 ICAM-1，1∶100稀釋)37 ℃孵育4 h→滴加二抗(羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體， 1∶200稀釋) →37 ℃孵育20 min→滴加SABC 37 ℃孵育20 min→DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間5 min，蒸餾水終止反應(yīng)→脫水封片→光鏡下觀察、照相和分析。

根據(jù)盲法原則，采用日本OLYMPUS公司的AX-70顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析及照相，每只大鼠取6張切片，每張切片隨機(jī)取2個(gè)視野照相。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定ICAM表達(dá)的平均光密度值(IOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色

圖1顯示，氣管周圍及肺組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞HE染色后呈藍(lán)色。對(duì)照組：細(xì)支氣管上皮完整，形態(tài)規(guī)則，支氣管壁不增生，肺泡形態(tài)規(guī)則，肺泡壁規(guī)則；模型組：氣管和肺組織周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管狹窄，上皮細(xì)胞分離，黏膜水腫，肺泡腔明顯變小;穴位組：與模型組比較，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管形態(tài)略微縮小，肺泡形態(tài)不規(guī)則;貼片組：與模型組比較，細(xì)支氣管形態(tài)較正常，腔內(nèi)無明顯上皮細(xì)胞脫落，壁內(nèi)炎癥細(xì)胞，肺泡形態(tài)不完善;穴位注射+貼片組：細(xì)支氣管形態(tài)規(guī)則，管周圍可見小炎癥細(xì)胞，黏膜正常，肺泡腔形態(tài)較規(guī)則，個(gè)別肺泡壁增厚，炎癥細(xì)胞增多。

2.2 各組血清IL-10、IL-17和IgE含量比較

表1顯示，血清IL-10、IL-17和IgE含量統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，模型組大鼠IL-17、IgE高于正常組，IL-10低于正常組，差異顯著(P<0.05)；3個(gè)治療組的IL-17和IgE均低于模型組，IL-10高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 IL-17含量：應(yīng)用組+注射組低于應(yīng)用組和注射組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 穴位組與斑塊組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。 IgE含量：貼劑+穴位注射組的應(yīng)用低于穴位注射組和應(yīng)用組(P<0.05)。 穴位注射組與放置組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。 IL-10含量：貼劑+穴位組高于貼劑組和空穴注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，穴位組與貼劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

2.3 各組大鼠肺組織ICAM-1的表達(dá)比較

表1圖2顯示，在正常組支氣管周圍觀察到少量棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞， 模型組在支氣管和支氣管分泌物以及間質(zhì)和肺泡棕黃色顆粒周圍具有更多表達(dá)。 ICAM-1的平均光密度高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 應(yīng)用組和穴位組中的棕黃色顆粒小于模型組。 ICAM-1的表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 斑塊+穴位組中棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)不明顯。 與注射組比較，ICAM-1的平均光密度低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 穴位組和貼劑組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

3 討論

支氣管哮喘(下稱哮喘)是一種呼吸道慢性炎癥性疾病，其病理生理學(xué)機(jī)制包括炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)與呼吸道組織和細(xì)胞間的復(fù)雜相互作用，導(dǎo)致急性支氣管痙攣，呼吸道壁水腫，黏液分泌增加和呼吸道重構(gòu),從而引起呼吸道阻塞。此外，炎癥還可以引起呼吸道反應(yīng)性增高。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制主要與免疫反應(yīng)有關(guān)，其中，呼吸道炎癥是哮喘發(fā)病的主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)中，模型組血清IL-10含量明顯低于對(duì)照組，表明在哮喘的炎癥階段IL-10的含量減低。IL-10是一類強(qiáng)大的免疫抑制因子，主要由CD4+CD25+ Tregs 細(xì)胞合成分泌。此外，TH2、TH1淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞也都是其來源[3]。IL-10可抑制促炎因子、趨化因子的合成以及與受體的結(jié)合，并且阻斷炎癥細(xì)胞釋放促炎癥細(xì)胞因子[4]。缺乏IL-10可能是哮喘的重要原因。 通常認(rèn)為，Th1 / Th2細(xì)胞因子的比例是不平衡的，并且TH2細(xì)胞因子的優(yōu)勢(shì)是哮喘的免疫學(xué)基礎(chǔ)。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，Treg / Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子IL-10 / IL-17的失衡也是哮喘發(fā)病機(jī)制的重要病理生理基礎(chǔ)[5]。

表1 各組血清IL-10、IL-17、IgE含量及ICAM-1在肺組織中IOD值表達(dá)比較

注： 與模型組比較：*P<0.05； 與穴注組比較：#P<0.05；與貼敷組、穴注組比較：△P<0.05; 與貼敷組、穴注組比較：▲P<0.05

圖1 各組大鼠肺組織HE染色比較

圖2 各組大鼠肺組織ICAM-1表達(dá)比較(免疫組化分析)

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-17明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與文獻(xiàn)關(guān)于IL-17具有促炎作用的研究相符合，提示IL-17對(duì)哮喘炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用。有研究顯示，IL-17水平可以作為評(píng)估嚴(yán)重支氣管哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。哮喘大鼠氣道的高反應(yīng)性依賴于TH17細(xì)胞應(yīng)答及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，表明TH17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17是促進(jìn)哮喘加重的關(guān)鍵因素[7]。實(shí)驗(yàn)中的模型組大鼠血清IL-17含量明顯高于正常組，而IL-10低于正常組，經(jīng)穴位貼敷組、穴位注射組、穴位注射+貼敷組治療后大鼠的血清IL-17含量較模型組降低，IL-10含量較模型組升高。同時(shí)HE染色顯示，血管周圍有少量炎癥細(xì)胞，支氣管形態(tài)規(guī)則，黏膜正常，肺泡腔形態(tài)規(guī)則。 上述結(jié)論進(jìn)一步表明，Treg細(xì)胞和TH17細(xì)胞之間的失衡是哮喘的重要原因[8]，Treg細(xì)胞分泌IL-10減少，可導(dǎo)致免疫細(xì)胞失衡而發(fā)生哮喘，而IL-10與IL-17的表達(dá)失衡，從某種方面也反映了Treg/TH17的失衡狀態(tài)。

該研究中的另一個(gè)指標(biāo)是細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)，在從血管到炎癥部位的白細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等積累中起關(guān)鍵作用[9]。 ICAM-1主要在白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肺組織中表達(dá)。當(dāng)哮喘發(fā)生時(shí)，ICAM-1可以介導(dǎo)和促進(jìn)上述細(xì)胞的黏附[10]。有研究表明，ICAM-1與哮喘的呼吸道炎癥有密切聯(lián)系，使用抗ICAM-1單抗能夠改善哮喘動(dòng)物模型呼吸道的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[11]。也有研究推斷[12]， ICAM-1能夠協(xié)同炎性因子加快嗜酸粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向氣道浸潤(rùn)，ICAM-1對(duì)于氣道炎癥程度的影響很大。模型組大鼠肺組織免疫組化的平均積分光密度(OD)值明顯高于正常對(duì)照組，表明在哮喘大鼠的炎癥階段，ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng)，減少ICAM-1的表達(dá)，可以減少氣道炎癥從而控制哮喘。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的內(nèi)病外治常配合穴位敷貼來完成。 穴位敷貼對(duì)于藥物有放大和增敏作用[13]。貼敷藥物由白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛、百部、五味子、前胡、麻黃組成。上述藥研磨過篩，加用姜汁、香油調(diào)制，選用辛香走竄之品，具有辛溫散寒平喘之功，配以行氣化痰、斂肺平喘藥物，達(dá)到祛痰鎮(zhèn)咳平喘的作用。加之對(duì)以上穴位的刺激，肺、脾、腎三臟同調(diào)，達(dá)到宣肺理氣、健脾化痰、培元固本的作用。此外，草分枝桿菌是一種滅活的非病原性細(xì)菌[14]，能夠促進(jìn)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生γ-IFN、IL-4，促進(jìn)TH細(xì)胞成熟，上調(diào)TH1細(xì)胞功能，從而調(diào)節(jié)Th1 /Th2的平衡，起到防治哮喘的作用[15]。并且能夠提高機(jī)體IgG、IgM的水平，從而調(diào)整T細(xì)胞亞群的含量，發(fā)揮提高免疫功能的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)將草分枝桿菌作為穴位注射藥物注射于哮喘大鼠模型，為草分枝桿菌的應(yīng)用尋找新的注射方法，也是尋找哮喘防治更有效的手段。穴位敷貼組、穴位注射組、穴位注射+黏連組ICAM-1的表達(dá)均低于模型組，表明3種方法均有效。 穴位組和斑塊組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，穴位暴露組ICAM-1表達(dá)低于其他組。 結(jié)果表明，3種方法均可通過降低肺組織ICAM-1的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞的積聚，減輕哮喘的癥狀。 應(yīng)用效果與穴位注射相似，穴位注射聯(lián)合應(yīng)用效果更好。

綜上所述，穴位注射聯(lián)合貼敷可提高哮喘大鼠血清IL-10含量，降低IL-17、IgE水平及ICAM-1的表達(dá)。