王 崢，李建鵬，張 翥，彭貴軍

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000； 2. 河南省中醫(yī)院,鄭州 450002)

糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，病理改變主要有腎小球高濾過、腎小球基底膜增厚、微量白蛋白尿濾出、腎功能下降至終末期腎衰竭，其確切發(fā)病機制至今尚未闡明。隨著學(xué)者們對炎癥因素在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中作用機制的認(rèn)識，以及抗炎治療在動物模型中取得成功的例子，阻斷免疫炎癥將可能成為治療糖尿病腎病的新手段。本研究通過觀察復(fù)方積雪草顆粒積芎解毒方對糖腎大鼠模型腎組織炎癥因子含量水平的影響，探討對糖腎大鼠的腎保護(hù)作用及可能機制，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性 SD 大鼠 60 只，體質(zhì)量(200±20)g，由河南省動物實驗中心提供(動物許可證號SCXK(豫)2010-0002)。

1.2 藥物與試劑

積芎解毒方中藥顆粒劑(由積雪草、川芎、黃芪組成，江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號1607090)；福辛普利片(上海中美施貴寶公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；總蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、24 h尿蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔多克隆抗體NF-κB(美國abcam公司)；兔多克隆抗體AngⅡ(美國abcam公司)；羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker(美國Sigma公司)；RNA 提取試劑盒(北京天根生物有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)；SYBR Green 定量PCR 試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 動物分組、造模及給藥方法

60只大鼠隨機選取10 只為正常對照組，普通飼料喂養(yǎng)，余大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，給予 2% 鏈脲菌素(STZ) 60 mg·kg-1的劑量一次性腹腔注射，正常對照組則注射等量的枸櫞酸緩沖液。大鼠自由飲水進(jìn)食 72 h 后，尾靜脈全血血糖≥ 16.7 mmol·L-1作為糖尿病模型造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。正常喂養(yǎng)4周后 24 h尿蛋白定量(UTP) ≥30 mg 者判定糖尿病腎病大鼠造模成功，納入實驗。造模成功大鼠隨機分為模型對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、福辛普利組各10只。

根據(jù)陳奇主編《中藥藥理學(xué)研究方法》，將積芎解毒方中藥顆粒(黃芪30 g,川芎20 g,積雪草30 g)用三蒸水溶解配制成高濃度生藥0.5 g/ml，中濃度生藥0.25 g/ml，低濃度生藥0.125 g/ml，按2 ml/100 g·d-1劑量分別給予高、中、低中藥劑量組大鼠灌飼，福辛普利組給予福辛普利 0.167 mg /100 g·d-1灌飼，正常對照組與模型對照組大鼠每日予生理鹽水2 ml/100 g·d-1劑量灌飼，連續(xù)給藥8 周。第8周末代謝籠收集24 h尿液，后處死大鼠取血；取腎皮質(zhì)0.2 g，制成勻漿液保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 生化指標(biāo)檢測

大鼠的血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、24 h尿蛋白定量(UTP)等采用自動生化分析儀測定。

1.5 Real time PCR技術(shù)檢測各組腎組織核因子Kappa B(NF-кB)、血管緊張素-Ⅱ(AngⅡ)mRNA 的表達(dá)

取腎皮質(zhì)，采用Trizol法提取總RNA進(jìn)行RNA 的濃度測定，然后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s， 60℃30 s，擴(kuò)增50 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，采用△△Ct 法進(jìn)行相對定量分析，以2-△△Ct作為目的RNA 的相對表達(dá)量。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計提供，引物序列: β-actin引物上游：5'-AGG CCG GCT TCG CGGGCG AC-3'，下游：5'-CAG GGG AGC CACACG CAG CTC-3'，擴(kuò)增判斷243 bp；NF-кB引物上游：5'-TCAGACACCTTTGCACTTGG-3'，下游：5'-GATAAGGAGTGCTGCCTTGC-3'，擴(kuò)增判斷187 bp；AngⅡ引物上游：5'-GCCAGATACTGCGAAAGCATGA -3'，下游：5'-GCTTCCATTCGCACCACAGA -3'，擴(kuò)增判斷186 bp。

1.6 Western Blot技術(shù)檢測各組腎組織NF-кB、AngⅡ蛋白的表達(dá)

腎組織勻漿離心后去上清液，采用BCA法測定蛋白定量，處理后的蛋白樣品SDS-PAGE凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)印膜，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker為參照，依分子量大小切取條帶，5%脫脂奶粉封閉。一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，用掃描儀掃描特異性蛋白條帶。利用Image J 圖像分析系統(tǒng)讀取內(nèi)參β-actin及目的蛋白條帶的平均灰度值，目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

表1顯示，與模型對照組比較，各治療組UTP明顯下降，TP、ALB 均明顯升高，其中中藥高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，與福辛普利組相似(P>0.05)，中藥中劑量組與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組與高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各組ALT、AST變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

注：與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01; 與中藥高劑量組比較:△P<0.05.

2.2 各組大鼠腎組織NF-KB、AngⅡ表達(dá)比較

圖1 各組NF-KB、AngⅡ蛋白免疫印跡條帶圖

表2圖1顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎組織NF-кB KB、AngⅡ mRNA水平及蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，各治療組NF-кB、AngⅡ mRNA水平及蛋白表達(dá)均明顯降低，其中中藥高劑量組優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，與福辛普利組相似(P>0.05)，中藥中劑量組與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組與高劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組腎組織NF-кB、AngⅡ mRNA、蛋白表達(dá)比較

注：與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01; 與中藥高劑量組比較:△P<0.05

3 討論

中醫(yī)古籍雖未見糖尿病腎病這一疾病名稱，但從其臨床表現(xiàn)及發(fā)展機制來看，屬于中醫(yī)“消渴”“水腫”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，稟賦不足、飲食不節(jié)、勞欲過度、情志失調(diào)為糖尿病腎病的病因。其病理機制關(guān)鍵是本虛標(biāo)實，本虛為氣血、陰陽、五臟之虛，標(biāo)實為水濕、瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物。中醫(yī)藥在糖尿病腎病的治療中已積累了較豐富的經(jīng)驗，特別是在延緩糖尿病腎病病程進(jìn)展，提高生存質(zhì)量等方面具有一定的優(yōu)勢[1]。有資料表明，中醫(yī)藥在治療糖尿病腎病有一定療效，且能減緩西藥副作用，延緩終末期腎臟病的發(fā)生，但仍有不足。如治療方案多樣化、不統(tǒng)一、小樣本觀察病例研究為多，可比性、重復(fù)性差，缺乏循證醫(yī)學(xué)多中心大樣本協(xié)作研究，藥物作用機理研究少等。因此借助現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，加強基礎(chǔ)研究，篩選有效的中藥制劑是防治糖尿病腎病的重要目標(biāo)。本研究小組依據(jù)各家[2-3]及前期臨床經(jīng)驗研究[4-5]，總結(jié)本病以氣虛瘀毒為主要病機特點，在疾病的不同發(fā)展階段，病機的側(cè)重點也不盡相同，總屬本虛標(biāo)實，確立“益氣活血解毒”作為各期的基本治法，選用多年臨床總結(jié)的積芎解毒方作為基礎(chǔ)治療方案。其組方為黃芪、川芎、積雪草，以黃芪益氣健脾補腎治療糖尿病腎病之本虛；以川芎活血祛瘀通絡(luò)，積雪草清熱利濕、解毒消腫治療糖尿病腎病之標(biāo)實?，F(xiàn)代藥理研究證實，黃芪對腎小球基底膜電荷屏障和機械屏障均有保護(hù)作用[6]，從而減輕通透性蛋白尿，并可改善局部血流動力學(xué)異常，減輕或延緩腎功能進(jìn)展。川芎可用于機體免疫調(diào)控，改善高凝狀態(tài)，減輕腎小球病理損害，降低慢性腎衰竭大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá),延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展[7]。積雪草可抑制肌成纖維細(xì)胞的增生、聚集，抑制腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，減輕腎小管間質(zhì)的損傷，發(fā)揮抗腎纖維化作用[8-9]。

糖尿病腎病被認(rèn)為是一種炎癥性疾病[10-11]，目前發(fā)現(xiàn)的糖尿病腎病炎癥信號傳導(dǎo)通路主要有MAPK信號傳導(dǎo)通路、TLR信號傳導(dǎo)、NF-kB抑制物激酶(IKK)/NF-kB信號通路等，通過各種炎癥因子如NF-кB、AngⅡ、TGF-β1、MCP-1等在這些通路中起主要介導(dǎo)作用，參與龐大復(fù)雜的免疫炎癥反應(yīng)過程[12-14]，最終引起不同程度的腎臟損害。NF-кB在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，糖尿病狀態(tài)下葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖基化終末產(chǎn)物生成、多元醇途徑活性增強等均可導(dǎo)致NF-кB激活、堆積，NF-кB活化后能誘導(dǎo)許多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)蛋白尿增加、腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化[15]。AngⅡ不僅是一種血管活性因子，與高糖具有協(xié)同效應(yīng)，還作為一種炎癥因子，通過與靶細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，使靶細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的活性改變，通過激活NF-кB促進(jìn)MCP-1的合成，參與腎臟組織中單核細(xì)胞的募集反應(yīng)，介導(dǎo)腎組織的炎癥反應(yīng)，是影響慢性腎臟病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)之一[16]。

本實驗結(jié)果顯示，糖尿病腎病模型對照組大鼠腎組織內(nèi)炎癥因子NF-кB、AngⅡmRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常組，表明糖尿病腎病時炎癥信號傳導(dǎo)通路的激活以及各種細(xì)胞因子的介導(dǎo)，調(diào)節(jié)著糖尿病腎病進(jìn)展中炎癥反應(yīng)過程。積芎解毒方高劑量組可下調(diào)糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥因子的表達(dá)，具有降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白、提高血清蛋白的作用，與福辛普利組作用相似，且沒有明顯的肝損。提示積芎解毒方對糖尿病腎病大鼠的腎保護(hù)作用，可能與抑制炎癥信號傳導(dǎo)通路的激活、降低免疫炎癥反應(yīng)、從而延緩腎功能進(jìn)展有關(guān)，但其具體作用機制還需進(jìn)一步探討。