柏文婕,石清蘭，毛德文,呂 超

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530200； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科,南寧 530023)

乙型肝炎病毒(HBV)通過(guò)直接損傷、炎性反應(yīng)等途徑可使肝臟發(fā)生纖維化[1]。肝纖維化是乙型肝炎發(fā)展為肝硬化甚至肝癌之前的一種可逆轉(zhuǎn)性病理過(guò)程，對(duì)早期肝纖維化進(jìn)行治療是降低肝硬化、肝癌發(fā)生的有效途徑之一[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療慢性乙型肝炎肝纖維化主要采取核苷類似物、干擾素、保肝類藥物等，但抗肝纖維化的療效仍有待提高，且副作用較大[3]。中醫(yī)藥對(duì)肝纖維化具有多環(huán)節(jié)、分階段、多靶點(diǎn)的藥理學(xué)效應(yīng)[4]。慢性乙肝屬于中醫(yī)學(xué)“黃疸”“脅痛”等范疇，肝郁脾虛為其常見(jiàn)證候，主要表現(xiàn)為肝氣郁結(jié)不暢、肝病及脾，致脾氣耗損，治宜疏肝健脾[5]。柴芍六君湯為《醫(yī)學(xué)正傳》古方六君子湯加柴胡、白芍而成。文獻(xiàn)報(bào)道，柴芍六君湯可改善肝郁脾虛型慢性乙型肝炎患者的癥狀，減輕蛋白尿，對(duì)肝功能有一定的保護(hù)作用[6]。本課題組在西醫(yī)常規(guī)療法基礎(chǔ)上采取柴芍六君湯治療慢性乙型肝炎肝郁脾虛證肝纖維化患者53例，并與同期單純西醫(yī)常規(guī)治療的48例患者進(jìn)行對(duì)照觀察，并探討其可能的作用途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年10月廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科收治的慢性乙型肝炎肝纖維化患者106例，按隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和對(duì)照組各53例。本組患者的依從性好，未發(fā)生脫落病例。對(duì)照組男性31例，女性22例；年齡40～49歲，平均年齡(44.31±5.57)歲；病程15～41個(gè)月，平均病程(30.40±3.99)個(gè)月；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)(165.93±18.33)U/L。觀察組男性33例，女性20例；年齡39～46歲，平均年齡(43.91±5.82)歲；病程17～40個(gè)月，平均病程(29.71±3.81)個(gè)月；ALT(165.77±18.51)U/L。2組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 慢性乙型肝炎診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]標(biāo)準(zhǔn)，肝纖維化診斷符合《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[8]標(biāo)準(zhǔn)，肝郁脾虛證診斷符合《慢性乙型肝炎中醫(yī)診療指南(2018年版)》[9]標(biāo)準(zhǔn)。主癥：脅肋脹痛；腹脹便溏。次癥：納呆食少；身倦乏力；舌質(zhì)淡有齒痕。20歲≤年齡≤60歲。乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)均陽(yáng)性，且HBV-DNA復(fù)制數(shù)>103拷貝/mL；患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并心腦血管、肺、肝腎等系統(tǒng)嚴(yán)重障礙；肝炎后肝硬化失代償期，或重型慢性乙型肝炎者；精神病者；停用抗病毒治療未達(dá)6個(gè)月及以上者；合并藥物性肝炎、酒精性肝病以及其他慢性肝病者；同時(shí)合并甲、丙、戊、丁型肝炎病毒者；伴惡性腫瘤者；合并其他中醫(yī)證型者。

1.3 治療方法

基礎(chǔ)治療采取恩替卡韋分散片(蘇州東瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20100129)口服治療，每次0.5 mg，每日1次。對(duì)照組給予中藥安慰劑(由玉米粉、焦糖色和苦味劑等組成)治療，該安慰劑無(wú)效、無(wú)毒，且在外觀、顏色以及氣味等方面基本與柴芍六君湯一致，服用方法與柴芍六君湯相同。觀察組采取柴芍六君湯內(nèi)服：黨參 15 g，白術(shù) 10 g，茯神 30 g，炙甘草 9 g，陳皮10 g，半夏 5 g，柴胡5 g，白芍30 g；藥物飲片均來(lái)自本院藥學(xué)部制劑室，由全自動(dòng)中藥煎藥機(jī)統(tǒng)一煎制成口服液，每日1 劑，水煎至約200 mL，分早晚2 次溫服，2組患者療程均為24周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 2組肝郁脾虛證癥狀評(píng)分 參見(jiàn)《慢性乙型肝炎中醫(yī)診療專家共識(shí)》[10]按4級(jí)評(píng)價(jià)患者的脅肋脹痛、腹脹、便溏、納呆食少、身倦乏力，分別評(píng)分為無(wú)(0分)、輕度(2分)、中度(4分)、重度(6分)，在治療前及治療結(jié)束后各測(cè)評(píng)1次。

1.4.2 2組肝功能 晨起患者空腹下抽取外周血3 mL，離心取血清于-70 ℃待測(cè)；使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、γ-谷氨酸?；D(zhuǎn)移酶(GGT)水平，在治療前及治療結(jié)束后測(cè)定1次。

1.4.3 2組肝纖維化 采集血清同上，采取化學(xué)發(fā)光分析儀(邁瑞Mindray，CL-2000i)測(cè)量透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、層黏蛋白(LN)水平；HA試劑盒由博奧賽斯生物科技有限公司提供(批號(hào)津食藥監(jiān)械字2012第2400049號(hào))，PCⅢ試劑盒由博奧賽斯(天津)生物科技有限公司提供(批號(hào)津食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第2400048號(hào))，Ⅳ-C由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供(批號(hào)京藥監(jiān)械字2011第2400189號(hào))，LN由上海勁馬生物科技有限公司提供(批號(hào)FR-A-080)。

1.4.4 2組HBV標(biāo)志物及定量 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)HBsAg、HBeAg，試劑盒由英科新創(chuàng)科技有限公司提供。主要步驟：將100 μL待測(cè)樣品37 ℃處理1 h，蒸餾水稀釋30倍備用，每孔加洗滌液 30 s后，重復(fù)3次，拍干；每孔加酶標(biāo)抗體100 μL，37 ℃處理，洗滌；顯色、終止反應(yīng)；在酶標(biāo)儀上以450 nm波長(zhǎng)依次測(cè)量各孔的吸光度(A值)。PCR法檢測(cè)HBV-DNA載量，HBV-DNA復(fù)制數(shù)<103拷貝/mL為陰性，試劑盒由廣州中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供(批號(hào)20140307)。主要步驟：PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分析，記錄儀器分析未知標(biāo)本數(shù)值(M)。

1.4.5 2組外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞17(Th17)比率 Th17細(xì)胞檢測(cè)：常規(guī)取靜脈血，肝素抗凝并懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加于血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上，梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，加入PMA、離子霉素刺激4 h，加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑； FITC-CD4 抗體處理、洗滌，固定液孵育、洗滌，Alexa Fluor647-IL-17 抗體孵育20 min、洗滌。Treg細(xì)胞檢測(cè)：取靜脈血和制作細(xì)胞懸液同上，F(xiàn)ITC-CD4 抗體處理后洗滌細(xì)胞，加入固定液、破膜液孵育， PE-Foxp3 抗體孵育20 min，洗滌重懸細(xì)胞；上流式細(xì)胞儀(FC-500型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)檢測(cè)。

1.5 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)[11]

顯效：肝郁脾虛證癥狀評(píng)分減少≥70%，血清肝功能基本正常，肝纖維化指標(biāo)至少2項(xiàng)較治療前下降≥50%或恢復(fù)正常；有效：肝郁脾虛證癥狀評(píng)分減少≥30%但<70%，血清肝功能指標(biāo)改善，血清肝纖維化指標(biāo)≥2項(xiàng)測(cè)定值較治療前下降≥25%但<50%；無(wú)效：肝郁脾虛證癥狀評(píng)分減少<30%，肝功能指標(biāo)無(wú)明顯改善，血清肝纖維化指標(biāo)未見(jiàn)好轉(zhuǎn)。總有效率=(顯效+有效)例數(shù)/總例數(shù)。肝郁脾虛證癥狀評(píng)分=(治療前評(píng)分-治療后評(píng)分)/治療前評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組肝郁脾虛證癥狀評(píng)分比較

表1顯示，2組治療24周后患者的肝郁脾虛證癥狀(脅肋脹痛、腹脹、便溏、納呆食少、身倦乏力)評(píng)分均顯著減少(P<0.01)；治療24周后，觀察組患者上述癥狀評(píng)分顯著少于對(duì)照組(P<0.01)。

表1 2組肝郁脾虛證癥狀評(píng)分比較(分，

注：與本組治療前比較：##P<0.01；與對(duì)照組治療后比較：△△P<0.01

2.2 2組肝功能比較

表2顯示，2組治療24周后患者的AST、ALT、TBIL、GGT水平顯著降低(P<0.01)；觀察組治療24周后AST、ALT、TBIL、GGT水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

表2 2組肝功能比較

注：與本組治療前比較：##P<0.01；與對(duì)照組治療后比較：△△P<0.01

2.3 2組肝纖維化指標(biāo)比較

表3顯示，2組治療24周后患者的肝纖維化(HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN)明顯降低(P<0.01)；觀察組治療24周后患者的上述肝纖維化指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

表3 2組肝纖維化指標(biāo)比較

注：與本組治療前比較：##P<0.01；與對(duì)照組治療后比較：△△P<0.01

2.4 2組臨床療效比較

表4顯示，治療24周后觀察組總有效率(90.57%)明顯高于對(duì)照組(73.58%)(P=0.043<0.05)。

表4 2組臨床療效比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較：χ2=4.104，*P<0.01

2.5 2組HBsAg、HBeAg、HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率比較

表5顯示，治療24周后觀察組的HBsAg轉(zhuǎn)陰率(75.47%)、HBeAg轉(zhuǎn)陰率(47.17%)、HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率(77.36%)分別明顯高于對(duì)照組HBsAg轉(zhuǎn)陰率(50.94%)、HBeAg轉(zhuǎn)陰率(26.42%)、HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率(54.72%)。

表5 2組HBsAg、HBeAg、HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率比較[例(%)]

2.6 2組外周血Treg/Th17細(xì)胞比率比較

表6圖1顯示，2組治療24周后患者的外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比率顯著減少(P<0.01)；觀察組治療24周后外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及Treg/Th17比率明顯少于對(duì)照組(P<0.01)。

表6 2組外周血Treg/Th17細(xì)胞比率比較

注：與本組治療前比較：##P<0.01；與對(duì)照組治療后比較：△△P<0.01

注：A、B：Treg細(xì)胞治療前(A)和治療后(B)變化，其中右上象限表示Treg細(xì)胞百分率;C、D：Th17細(xì)胞治療前(C)和治療后(D)變化，其中右上象限表示Th17細(xì)胞百分率。圖1 慢性乙型肝炎患者治療前后外周血中Th17/Treg細(xì)胞百分率比較

3 討論

慢性乙型肝炎病位在肝，與脾胃聯(lián)系密切，肝為木，主疏泄，性喜條達(dá)而惡抑郁；脾為土，主運(yùn)化；肝氣郁結(jié)易招木旺乘土。肝郁脾虛是臨床常見(jiàn)病機(jī)之一[12]?！端貑?wèn)·至真要大論篇》指出：“木之勝也，土濕受邪，脾病生焉”。由于乙肝病毒侵犯，引起肝氣郁結(jié)不暢，郁怒傷肝，肝失調(diào)達(dá)，橫乘脾土，繼而肝病及脾，同時(shí)病程反復(fù)致脾氣耗損；或由于飲食不節(jié)、勞倦太過(guò)，或外感濕熱等，損傷脾胃，脾失健運(yùn)，濕雍木郁，累及于肝膽，導(dǎo)致肝失疏泄[13]。故立疏肝理氣、健脾化濕之治法。

柴芍六君湯方中柴胡苦平，入肝膽經(jīng)，透泄少陽(yáng)之邪，并能疏泄氣機(jī)之郁滯，使少陽(yáng)半表之邪得以疏散；重用白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛；黨參甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；白術(shù)苦溫，健脾燥濕，加強(qiáng)益氣助運(yùn)之力；佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，與茯神、白術(shù)相配，使健脾之功益著；本方以茯神易茯苓，乃因慢乙肝患者多見(jiàn)肝郁，思慮過(guò)多，夜寐欠佳，影響肝功能恢復(fù)，茯神在《藥物化義》中入心、脾二經(jīng)，在《要藥分劑》中入心經(jīng)兼入肝經(jīng)，有寧心、安神之效，能改善睡眠，促進(jìn)肝功能恢復(fù)；半夏辛溫而燥，化濕祛痰，降逆和胃止嘔；陳皮調(diào)理氣機(jī)以除胸脘痞悶，止嘔以降胃氣，燥濕化痰以消濕聚之痰，使氣順而痰消；柴胡疏肝解郁，使肝氣條達(dá)；炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥；四藥配伍，共奏疏肝理氣、健脾化濕之功。

本研究結(jié)果顯示，治療24周后，觀察組患者肝郁脾虛證癥狀(脅肋脹痛、腹脹、便溏、納呆食少、身倦乏力)評(píng)分顯著低于對(duì)照在，提示加用柴芍六君湯有助于改善慢性乙型肝炎肝郁脾虛證患者的中醫(yī)證候，觀察組患者的肝功能指標(biāo)AST、ALT、TBIL、GGT和肝纖維化指標(biāo)HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明加用柴芍六君湯可進(jìn)一步改善慢性乙型肝炎肝郁脾虛證患者的肝功能，發(fā)揮更好抗纖維化作用；治療24周后療效統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)現(xiàn)，觀察組總有效率(90.57%)以及HBsAg、HBeAg、HBV-DNA轉(zhuǎn)陰率明顯高于對(duì)照組，提示加用柴芍六君湯治療慢性乙型肝炎肝郁脾虛證患者肝纖維化的療效更佳。Treg與Th17細(xì)胞均為CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞型，Treg抑制特異性免疫反應(yīng)，有利于慢性乙型肝炎疾病的進(jìn)展；Th17細(xì)胞具有促炎癥反應(yīng)的作用，通過(guò)促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及組織損傷，加重肝細(xì)胞損傷；二者之間的平衡是慢性炎癥持續(xù)發(fā)展的重要因素之一[14,15]。慢性乙型肝炎患者的Treg、Th17細(xì)胞水平都明顯增加，以Th17細(xì)胞升高為主，Treg/Th17比率變化可提示患者體內(nèi)免疫功能增減，慢性乙型肝炎患者的Treg/Th17比率處于免疫失衡狀態(tài)，Treg /Th17比率是臨床判定慢性乙型肝炎患者病情輕重、療效、預(yù)后的有效指標(biāo)[16-17]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)[18-20]，人參主要組方人參皂苷Rb1可改善自發(fā)性高血壓下的Th17 /Treg 細(xì)胞平衡，半夏提取物通過(guò)改善Treg/Th17比例發(fā)揮增強(qiáng)免疫的作用，白芍總苷通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡及其相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮抑炎效果。本研究結(jié)果顯示：治療24周后，觀察組患者外周血Treg/Th17比率明顯少于對(duì)照組，說(shuō)明柴芍六君湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)Treg/Th17比率，改善慢性乙型肝炎患者的免疫網(wǎng)絡(luò)平衡，從而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上，柴芍六君湯治療慢性乙型肝炎肝郁脾虛證可促進(jìn)患者中醫(yī)證候、肝功能和肝纖維化的改善，提高臨床療效和抗病毒效果，調(diào)節(jié)Treg/Th17比率可能是其作用途徑之一，值得臨床借鑒使用。