王玉青，鄔長(zhǎng)松，馬潔樂，陳會(huì)杰，劉小玲

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，武漢 430070)

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是一氧化氮(nitric oxide，NO)合成的關(guān)鍵酶，具有催化L-精氨酸氧化生成L-瓜氨酸和一氧化氮的功能。根據(jù)NOS的來(lái)源及催化特性的不同，可將其分為神經(jīng)型NOS(neuronal nitric oxide synthase，nNOS或NOS1)、誘導(dǎo)型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS或NOS2)和內(nèi)皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS或NOS3)三種亞型[1-3]。1989年，NOS2被首次報(bào)道[4]，目前普遍認(rèn)為，NOS2主要存在于巨噬細(xì)胞中，也存在于肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞內(nèi)。NOS2是二聚體，每一個(gè)亞基都含有兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)區(qū)域是包含亞鐵血紅素和四氫生物蝶呤的氧化區(qū)，另一個(gè)區(qū)域是結(jié)合FAD、FMN和NADPH的還原區(qū)。當(dāng)生物體受到細(xì)菌等外界因素或內(nèi)源性炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)的刺激后，NOS2被誘導(dǎo)表達(dá)，隨后催化合成大量的NO，產(chǎn)生的NO可參與多種免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，具有殺菌、抗病毒和抗寄生蟲等多種免疫效應(yīng)[5]。

團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)，俗稱武昌魚，我國(guó)特有的淡水鯉科魚類。近年來(lái)細(xì)菌病的暴發(fā)，導(dǎo)致大量的團(tuán)頭魴死亡，從而給團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是公認(rèn)的感染魚類的重要病原菌，屬于弧菌科氣單胞菌屬，是典型的人畜魚共患病病原[6]。2010年，田甜等[7]報(bào)道嗜水氣單胞菌可引起團(tuán)頭魴急性出血性敗血癥。細(xì)菌性敗血癥對(duì)養(yǎng)殖魚類危害最重，暴發(fā)傳播的速度極快，患病魚死亡率很高[8]。在敗血癥過(guò)程中，致炎因子和內(nèi)毒素可引起多種細(xì)胞和組織中NOS2的表達(dá)，從而產(chǎn)生大量的NO，過(guò)量的NO會(huì)造成細(xì)胞和組織損傷。

劉立等[9]研究證明，殼寡糖(chtiosanoligosaccharide，COS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以激活團(tuán)頭魴的巨噬細(xì)胞，上調(diào)NOS2的表達(dá)，增加NOS2的酶活，提高活性氮的表達(dá)水平。然而，病原菌感染團(tuán)頭魴時(shí)NOS2基因的組織表達(dá)水平及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)克隆了團(tuán)頭魴NOS2基因的全長(zhǎng)cDNA序列，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后NOS2基因在肝臟、脾臟、頭腎和腸中的表達(dá)變化，旨在探究NOS2在團(tuán)頭魴個(gè)體免疫中發(fā)揮的作用，為后續(xù)研究其在細(xì)菌感染后的免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用團(tuán)頭魴體重為400 g左右，購(gòu)自湖北百榮水產(chǎn)良種有限公司，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地淡水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)兩周，待供試魚適應(yīng)環(huán)境，并確認(rèn)無(wú)疾病癥狀后，用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間水溫控制在25～26 ℃，水源為充分曝氣的自來(lái)水，使用充氣泵24 h不間斷充氧，每天分兩次投喂(8∶00，17∶00)，每次投喂相當(dāng)于魚體重1.5%的人工配合飼料(武漢海大飼料有限公司生產(chǎn))。

病原：供試菌株為筆者所在研究室保存的嗜水氣單胞菌(AhJ-1株系)，該株系為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。將菌株接種在LB液體培養(yǎng)基(1 L培養(yǎng)液中，含酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，調(diào)節(jié)pH至7.4)中，28 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集細(xì)菌，磷酸鹽平衡鹽溶液(PBS)洗滌三次，調(diào)整菌液濃度為3×107CFU/mL，作為攻毒菌液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取

解剖3尾健康團(tuán)頭魴，取頭腎30～50 mg，根據(jù)總RNA提取試劑盒RNAiso Plus (TAKARA)的操作說(shuō)明，提取總RNA。用微量核酸測(cè)定儀NanoDrop 2000測(cè)定RNA的純度及濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑按照既定步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA (PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TAKARA)。

1.2.2 團(tuán)頭魴NOS2基因cDNA片段的克隆

根據(jù)草魚NOS2基因的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增團(tuán)頭魴的中間序列，根據(jù)中間序列設(shè)計(jì)特異性引物，以團(tuán)頭魴頭腎cDNA為模板，按照Takara公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒，擴(kuò)增NOS2基因的3′和5′端，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α(全式金，北京)中，選取陽(yáng)性克隆的菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

用DNASTAR軟件對(duì)測(cè)序后獲得的序列進(jìn)行拼接，得到NOS2的cDNA全長(zhǎng)。采用在線BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)NOS2的cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行同源性檢索。使用ExPASy網(wǎng)站(https://www.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)氨基酸序列并且分析氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和功能結(jié)合位點(diǎn)。使用clustalX軟件進(jìn)行多重序列比較，同時(shí)用MEGA6.0(Neighbor-Joining，NJ法)構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后NOS2基因的表達(dá)變化

魚體感染和取樣參照Liu等[10]的方法并稍加改動(dòng)，選取健康的團(tuán)頭魴50尾，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組注射100 μL上述菌液，對(duì)照組注射等量的PBS。在注射后0、3、6、12、24、48、72 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取3尾活魚，抽取血液后，解剖分離出30～50 mg左右的肝臟、脾臟、頭腎和腸，分別放入加有1 mL預(yù)冷Trizol的1.5 mL的EP管中，凍存于-80 ℃冰箱。所有樣品取完后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用熒光定量PCR對(duì)NOS2基因進(jìn)行表達(dá)分析。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線從65 ℃到95 ℃。qPCR反應(yīng)在羅氏480熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)定3組重復(fù)，以NOS2基因mRNA在不同組織中的表達(dá)量與β-actin的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比，作NOS2基因的相對(duì)表達(dá)量的分析，相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCT法[11]。為了方便觀察NOS2基因在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)將0h的NOS2的相對(duì)表達(dá)量的值設(shè)定為1。用SPSS16.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 團(tuán)頭魴NOS2基因cDNA全長(zhǎng)及序列特征

PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序之后，得到的序列經(jīng)過(guò)DNAstar軟件拼接，除去重疊序列和接頭序列，最后得到團(tuán)頭魴NOS2的cDNA全長(zhǎng)(所用引物見表1)。使用在線BLAST對(duì)獲得的序列和已報(bào)道的NOS2序列進(jìn)行同源性分析，該序列與草魚和斑馬魚的NOS2序列全長(zhǎng)相似性大于80%，說(shuō)明得到的序列為團(tuán)頭魴NOS2。核苷酸序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列登錄號(hào)為KJ668755。團(tuán)頭魴NOS2的cDNA序列全長(zhǎng)4 215 bp，5′非編碼區(qū)為197 bp，3′非編碼區(qū)為775 bp，開放閱讀框?yàn)? 243 bp，編碼1 080個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量約為122.51 kW，理論等電點(diǎn)為7.36。使用clustalX軟件對(duì)團(tuán)頭魴、草魚、斑馬魚、墨西哥脂鯉和虹鱒的序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用ExPASy網(wǎng)站在線分析其功能結(jié)合位點(diǎn)。如圖1所示，參與比對(duì)的序列N-末端都具有Heme、BH4和CAM結(jié)合位點(diǎn)，C-末端都具有FMN、FAD和NADPH結(jié)合位點(diǎn)，這些區(qū)域在硬骨魚類中高度保守。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in these experiments

圖1 團(tuán)頭魴NOS2的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of the NOS2 amino acid sequencesNOS2的保守一致序列用彩色陰影標(biāo)示，缺失的氨基酸殘基用破折號(hào)表示，下劃線標(biāo)示輔因子的結(jié)合位點(diǎn)

2.2 團(tuán)頭魴NOS2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了得到團(tuán)頭魴NOS2的進(jìn)化信息，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取33個(gè)NOS2的蛋白序列，將其進(jìn)行BLAST分析。用MEGA 6.0(Neighbor-Joining，NJ法)對(duì)33個(gè)NOS2的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。脊椎動(dòng)物的NOS分成NOS1、NOS2、NOS3三個(gè)分支，其中NOS1和NOS3與無(wú)脊椎動(dòng)物的NOS的親緣關(guān)系更近。團(tuán)頭魴與草魚、斑馬魚、鯉和金魚聚為鯉形目的一簇，其中團(tuán)頭魴的NOS2與草魚的NOS2親緣關(guān)系最近。9個(gè)魚類的NOS2組成了硬骨魚類的分支，同時(shí)與哺乳類、鳥類和爬行類聚為脊椎動(dòng)物NOS2分支。

圖2 團(tuán)頭魴NOS2和其它動(dòng)物的NJ分子進(jìn)化樹Fig.2 NJ-phylogenetic tree of the NOS2 gene constructed by using amino acid sequences團(tuán)頭魴NOS2用▲標(biāo)出。節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為自展置信值，自展重復(fù)1 000次，進(jìn)化樹分析所用蛋白見表2

2.3 團(tuán)頭魴NOS2基因在嗜水氣單胞菌感染后的表達(dá)變化

團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌至72 h，各組團(tuán)頭魴均無(wú)死亡。不同組織NOS2的表達(dá)水平如圖3所示，在肝臟組織中，NOS2在感染后3 h表達(dá)量極顯著上調(diào)，出現(xiàn)峰值，12 h顯著下調(diào)，隨后顯著上調(diào)，并且在48 h出現(xiàn)第二個(gè)峰值。在脾臟組織中，NOS2在感染后3 h表達(dá)量極顯著上調(diào)，出現(xiàn)峰值，6 h顯著下調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)極顯著下調(diào)表達(dá)。在頭腎組織中，NOS2在注射后3 h表達(dá)量達(dá)到最高，出現(xiàn)峰值，12 h恢復(fù)到注射前水平，在其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均是極顯著上調(diào)。在腸道組織中，NOS2在3 h極顯著下調(diào)表達(dá)，6 h顯著上調(diào)表達(dá)，24 h顯著下調(diào)表達(dá)。

圖3 嗜水氣單胞菌感染后，團(tuán)頭魴肝臟、脾臟、頭腎和腸中NOS2在mRNA水平的表達(dá)變化Fig.3 Changes of relative mRNA expression levels of the NOS2 in the liver，spleen，head-kidney and intestine of M.amblycephala after challenged with A.hydrophila

3 討論

本研究通過(guò)同源克隆和RACE技術(shù)獲得團(tuán)頭魴NOS2的cDNA全長(zhǎng)，預(yù)測(cè)蛋白分子量為122.51 KW，等電點(diǎn)7.36。氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果表明，團(tuán)頭魴的NOS2與草魚的NOS2和斑馬魚的NOS2b的相似度較高。氨基酸序列分析表明，NOS2的N-末端都具有Heme、BH4和CAM結(jié)合位點(diǎn)，C-末端都具有FMN、FAD和NADPH結(jié)合位點(diǎn)，與汪新艷等[12]在草魚上的研究結(jié)果一致。進(jìn)化分析表明，團(tuán)頭魴的NOS2在進(jìn)化關(guān)系上與草魚的NOS2最接近，與硬骨魚類的NOS2聚為一支，共同構(gòu)成脊椎動(dòng)物的NOS2分支，說(shuō)明不同種屬的NOS2的異構(gòu)體具有高度的同源性；團(tuán)頭魴NOS2與脊椎動(dòng)物NOS1和NOS3以及無(wú)脊椎動(dòng)物NOS的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)一步證實(shí)我們克隆的基因是NOS2。

在病原菌刺激時(shí)，不同物種、不同組織的NOS2表達(dá)變化存在差異[13-14]。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后NOS2在肝臟、頭腎、脾臟和腸道的表達(dá)變化。在肝臟中，NOS2在感染早期表達(dá)量極顯著上調(diào)，12 h顯著下調(diào)，隨后顯著上調(diào)。然而，Yao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦注射LPS后，NOS基因在肝胰腺中表達(dá)量顯著降低，可能是不同物種間的免疫系統(tǒng)存在差異性。肝臟參與魚類的非特異性免疫反應(yīng)，在細(xì)菌脂多糖、細(xì)胞因子等的誘導(dǎo)下，肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞和貯脂細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)NOS2[16]。溫振才[17]用嗜水氣單胞菌刺激鯉魚后檢測(cè)的NOS2組織表達(dá)情況表明，NOS2在頭腎中的表達(dá)量最高。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嗜水氣單胞菌刺激的團(tuán)頭魴的組織表達(dá)情況表明，NOS2在頭腎中亦被大量誘導(dǎo)表達(dá)。頭腎是魚類重要的免疫器官，當(dāng)受到外來(lái)病原體感染時(shí)，頭腎中的免疫細(xì)胞如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖分化，大量表達(dá)NOS2，進(jìn)而產(chǎn)生大量NO來(lái)對(duì)抗入侵的微生物[18-19]。在脾臟中NOS2在3 h上調(diào)表達(dá)，其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均顯著下調(diào)。郭建等[20]采用捕食應(yīng)激模式，發(fā)現(xiàn)大鼠脾臟NOS2活性程度與動(dòng)物心理應(yīng)激程度密切相關(guān)，應(yīng)激過(guò)程中NOS2活性增加，應(yīng)激后期NOS2的活性又逐漸降低。因此推測(cè)脾臟NOS2早期的上調(diào)表達(dá)可能是團(tuán)頭魴對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。在腸道組織中NOS2基因除了在6 h有微弱的上調(diào)表達(dá)之外，總體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。對(duì)大鼠腸道的研究表明，NOS2的表達(dá)水平與腸道病理?yè)p傷指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；調(diào)節(jié)NOS2活性，減少NO生成量，可減輕腸組織損傷[21-22]。以上結(jié)果為探究NOS2在團(tuán)頭魴個(gè)體免疫反應(yīng)中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

NOS2可以催化產(chǎn)生大量的NO，NO具有殺菌、抗腫瘤等防御作用，過(guò)量表達(dá)NO則加劇炎癥反應(yīng)，造成機(jī)體組織損傷，因此研究NOS2在先天性免疫反應(yīng)中的作用則顯得極其重要。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)證實(shí)團(tuán)頭魴TLR2參與抗嗜水氣單胞菌的免疫反應(yīng)[23]，Toll樣受體識(shí)別微生物的組分后被激活，活化NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，隨后轉(zhuǎn)錄因子激活NOS2的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)NOS2表達(dá)[24-25]。對(duì)于團(tuán)頭魴，NOS2的表達(dá)同TLR2-NF-κB是否存在聯(lián)系尚不清楚，其分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。目前對(duì)NOS2基因的研究多是在離體細(xì)胞水平[9，26]，而對(duì)個(gè)體水平中NOS2基因的表達(dá)調(diào)控及功能研究較少。本研究檢測(cè)了嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后其不同組織NOS2基因的表達(dá)水平及變化趨勢(shì)，為研究NOS2在團(tuán)頭魴抵御嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。