李亞麗，樸向民，逄世峰，曲正義，王英平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130122）

氨基酸是含有氨基的羧酸，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單元[1-2]。目前，已發(fā)現(xiàn)自然界中有300 余種氨基酸，其中，參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸有20多種，是基本氨基酸[3]。氨基酸在自然界中主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2 種形式存在。中草藥中2 種氨基酸形式皆存在，且大多為人體必需氨基酸，除具有營養(yǎng)價值外，在發(fā)揮藥效時亦起著不可或缺的作用[4]，如亮氨酸和纈氨酸等具有提高運動耐力、抗感染和修復(fù)組織作用。另外，非必需氨基酸亦可能有一定的藥效價值，如牛磺酸雖不是機體蛋白質(zhì)的構(gòu)成成分，但是缺乏?；撬峥梢鸲喾N心血管和中樞神經(jīng)性疾病[5]。谷酰胺或含谷酰胺的肽能防止新生兒腸上皮細胞由氧化劑誘導(dǎo)的氧化[6]；其次，氨基酸含量的高低可作為中草藥藥性判別的依據(jù)[7]；而且，指標(biāo)性氨基酸可用于定性鑒別中藥材[8]。從目前氨基酸在人體中的代謝來看，20 余種氨基酸的攝入量比例不當(dāng)時，會致使氨基酸總體利用率降低[5]。另外，某種氨基酸攝入量過大還會對人體構(gòu)成危害，如大量食用谷氨酸可能會引起頭疼和肩背痛等[9]。因此，中草藥中氨基酸分析可為中草藥鑒別、質(zhì)量評估及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。由于氨基酸含有氨基和羧基高極性基團，且一般具有揮發(fā)性低、無強發(fā)色基團等特點，其分離和檢測極具挑戰(zhàn)性。色譜法是氨基酸分析最有效和最常用的方法，分析前預(yù)處理是確保分析結(jié)果準(zhǔn)確無誤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。筆者擬對中草藥中氨基酸的前處理及色譜方法進行總結(jié)評述，并對氨基酸的前處理和色譜分析方法的發(fā)展趨勢進行展望，以期為今后氨基酸分析工作提供參考。

1 氨基酸高效液相色譜法分析前處理

1.1 粗氨基酸樣品制備

如需準(zhǔn)確無誤地檢測中草藥中氨基酸含量，除了熟練操作儀器外，樣品前處理是否得當(dāng)和正確也是確保檢測數(shù)據(jù)可靠的重要因素之一。結(jié)合態(tài)氨基酸和游離氨基酸的前處理方法大不相同[10]。

1.1.1 結(jié)合態(tài)氨基酸 對于全氨基酸分析，凡是以蛋白質(zhì)或多肽形式結(jié)合的氨基酸均需進行水解處理。傳統(tǒng)的氨基酸水解方法有酸水解法、堿水解法和酶水解法 3 種[11]。

酸水解法：酸水解法是最常采用的水解方法。標(biāo)準(zhǔn)的酸水解方法是在6 mol/L鹽酸、110 ℃真空條件下水解24 h[12]。大量試驗證明，蛋白質(zhì)中某些氨基酸，尤其是含硫氨基酸易受氧氣和多種化學(xué)試劑的氧化，因此，純化水解試劑和水解前除盡水解管中的氧對于準(zhǔn)確測定十分必要[13]。酸水解法的優(yōu)點是鹽酸可以通過加熱方法蒸發(fā)掉，缺點是氨基酸易于與含醛基的化合物反應(yīng)而致使溶液顯褐色；另外，鹽酸溶液中的重金屬可能使氨基酸遭受破壞。

堿水解法：標(biāo)準(zhǔn)的堿水解方法是在 2.5 mol/L NaOH 或LiOH 介質(zhì)中水解20 h。李遠坤[14]首先利用堿提取酸沉淀法提取蛋白質(zhì)，然后采用堿水解法對蛋白質(zhì)進行降解，蛋白的水解率為30%左右。堿水解法的優(yōu)點是水解液清亮，此過程色氨酸不受破壞，是測定色氨酸含量時常用的方法。但堿水解法缺點是水解后的氨基酸發(fā)生消旋作用，此過程還會釋放出氨氣和硫化氫；另外，絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸和胱氨酸等會遭到不同程度的破壞。

酶水解法：酶是有機催化劑，在常溫常壓下即可催化有機物質(zhì)的合成與分解。酶水解法優(yōu)點是水解條件溫和、無需特殊設(shè)備、氨基酸不受破壞，缺點在于水解不夠完全，目前未能發(fā)現(xiàn)某一種酶能完全水解所有蛋白質(zhì)；另外，與酸、堿水解法相比較，酶法水解氨基酸還需考慮酶試劑種類、量、溫度和pH 等因素；而且，其水解時間較長。Vesper 等[15]在不同緩沖液、不同溫度和水解時間條件下，對蛋白內(nèi)切酶及蛋白酶催化水解進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)蛋白內(nèi)切酶的穩(wěn)定性會隨溫度升高而下降，從而致使其水解度降低。因此，通常全氨基酸分析不推薦采用酶水解法。

目前，歐洲、日本和中國在植物蛋白水解生產(chǎn)上均采用酸水解法。此外，近年來發(fā)展的微波消解法用于結(jié)合態(tài)氨基酸的消解，其原理是通過能量傳遞，依靠分子間的極化而不是碰撞完成的。微波消解法由于水解時間短，適合大批量的樣品前處理。與常規(guī)水解法耗時長（20 h以上）、耗能大、不利于快速檢測大量樣品等特點相比較，微波消解法具有明顯的優(yōu)勢[16]。但是，此方法還有待于進一步研究。

1.1.2 游離氨基酸 游離氨基酸的樣品在分析前必須進行磨碎、脫脂、提取、脫鹽、去蛋白和脫色等處理。不同的樣品諸如烘干樣品和鮮樣所需提取條件不盡相同。

烘干樣品中游離氨基酸的提?。阂话阆刃枰稍锖头鬯樘幚?。趙復(fù)中等[17]用75%～80%乙醇提取游離氨基酸，也有人用蒸餾水常溫浸泡或加熱回流提取[18]。為了提高游離氨基酸的提取率，提取過程一般重復(fù)2～3次，然后合并、過濾提取液并濃縮，即得到游離氨基酸粗提液?；蛘卟捎谜麴s水超聲提取的方法或在室溫下試樣用50%乙醇微波萃取，然后離心、過濾，備用。

鮮樣中游離氨基酸的提?。乎r樣一般采用10%乙酸勻漿或研磨法進行提取[19]。鮮樣中的蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，致使游離氨基酸含量大幅升高，因此，研磨需要在冰浴條件下進行。鮮樣中可通過加入一定濃度的磺基水楊酸、醋酸鉛或95%乙醇沉淀，借助離心或過濾的方法去除蛋白質(zhì)，加入乙醚去除脂類，加入乙酸乙酯去除酚類物質(zhì)等[20]。

1.2 氨基酸純化

從植物原料中提取的氨基酸粗提液含有可溶性糖、色素、有機酸及其他雜質(zhì)，需要對其進一步純化方可準(zhǔn)確測定[21]。目前，常采用沉淀法、超濾法、高速離心法和離子交換法等純化方法，其中，732 陽離子交換樹脂法是最常用的純化方法[19]。離子交換法純化效果好，且氨基酸損失少，常用于中草藥中游離氨基酸粗物的純化。也可用活性炭純化法，但活性炭對部分氨基酸也能吸附，造成氨基酸的損失[22]。也可采用C18Sep-Pak 柱法對氨基酸進行純化，但價格昂貴。綜上所述，較佳的氨基酸粗提液的純化方法是陽離子交換樹脂法。

2 氨基酸色譜法分析

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法是用氣體做流動相的色譜法。氣相色譜法要求被分析物在 196～450 ℃溫度范圍能夠氣化，但氨基酸含氨基和羧基等極性基團，在溫度高時易分解，溫度低時又不易氣化，故采用氣相色譜法分析氨基酸前需要對其進行衍生化處理，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橐讱饣奈镔|(zhì)；另一方面，氣相色譜法分析樣品時的柱溫較高，因此，氨基酸衍生物的制備有很大難度。目前，適用于氨基酸衍生的衍生方法有硅烷化法、酯化法和?；ǖ龋@些衍生法雖具有靈敏度高的優(yōu)點，但衍生化反應(yīng)條件苛刻，要求在無水條件下進行，而且操作過程復(fù)雜，故氨基酸分析大多不采用氣相色譜法。近年來，科研工作者開始發(fā)展允許水存在條件下衍生[23]，有比較好的應(yīng)用前景。周芳等[24]將蓮子心氨基酸水解液通過雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷衍生后，采用石英毛細管柱進行GC-MS 檢測，結(jié)果可同時測得15 種氨基酸。張紅漫等[25]將中藥沙苑子用酸水解后，經(jīng)羥基脂化和氨基酞化的衍生化反應(yīng)，利用GCMS法可同時測定15 種氨基酸，為進一步開展沙苑子的藥效及藥理研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 高效陰離子色譜-積分脈沖安培法

高效陰離子色譜-積分脈沖安培法是一種無需柱前和柱后衍生化的氨基酸直接分析方法。該方法不需要衍生過程，可避免由于衍生而產(chǎn)生的誤差，且靈敏度高，測定氨基酸的檢測限可達到pmol 或fmol 濃度級；另外，試驗過程中流動相不使用甲醇、乙腈等有機試劑，而是采用水、氫氧化鈉和醋酸鈉溶液，是一種綠色環(huán)保的分析測定方法。Clarke 等[26]研發(fā)了一種高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測氨基酸的方法，該脈沖安培檢測方法具有穩(wěn)定性好和靈敏性高等優(yōu)點，但存在常規(guī)金電極易被污染需要經(jīng)常清洗的問題。針對此問題，Cheng 等[27]研制成功了“可拋棄”金電極用于氨基酸的分析測定，此方法無須經(jīng)常清洗電極，且可保證分析結(jié)果與普通金電極一致，是一種比較好的方法。

2.3 高效陽離子交換色譜法

高效陽離子交換色譜法是利用離子交換原理和結(jié)合液相色譜技術(shù)來測定溶液中能夠電離出陽離子物質(zhì)的一種分離分析方法。Spackman 等[28]利用氨基酸在酸性條件下形成陽離子的特性，將其在陽離子交換柱中分離，隨后用茚三酮進行衍生、檢測。此方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠，能測定大多數(shù)氨基酸及其同系物，但儀器靈敏度不高，且價格較貴。

2.4 液相色譜法

2.4.1 衍生法 所有氨基酸中，除色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有紫外吸收性質(zhì)外，其余氨基酸缺乏天然的紫外或熒光吸收，因此，進行紫外或熒光檢測前大多需要衍生。目前，已經(jīng)發(fā)展了多種柱前、在線或柱后衍生的方法[29]。其中，在線衍生法是在色譜柱內(nèi)進行衍生反應(yīng)，所需反應(yīng)試劑用量相對較少，但柱內(nèi)需要配備反應(yīng)攪拌裝置；柱后衍生法可使用多種檢測器，但要求反應(yīng)速率快、反應(yīng)室體積小。所以，目前使用較多的是柱前衍生方法，現(xiàn)已發(fā)展的柱前衍生試劑主要包括鄰苯二甲醛（OPA）[30]、異硫氰酸苯酯（PITC）[31]、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）[32]、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）[33]、二硝基氟苯（DNFB）[34]、1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺（FDNPAA）[35]、磺酰氯二甲胺偶氮苯（DABS-Cl）[36]、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（AQC）[37]和 2,4-二硝基氯苯（CDNB）[38]等。各種柱前衍生方法均有一定優(yōu)缺點（表1），如OPA 法不能檢測胱氨酸及亞氨基酸，且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性差，其最大優(yōu)點是無過量衍生試劑及副產(chǎn)物干擾；FMOC 法可檢測亞氨基酸，且衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，熒光和紫外均可檢測，缺點是不能檢測胱氨酸，副產(chǎn)物難以去除，對測定有干擾；Dansyl-Cl 法既可檢測亞氨基酸，又能檢測胱氨酸，衍生物穩(wěn)定性好，優(yōu)點是無副產(chǎn)物干擾，缺點是紫外檢測靈敏度較低；PITC 法可檢測亞氨基酸和胱氨酸，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，20 ℃可保存30 d，可采用真空干燥法去除多余衍生試劑，效果良好，但即使極微量的衍生試劑也可污染色譜柱而影響柱效。2006年6月，在天津市召開的藥品中氨基酸的測定方法研討會推薦首選測定方法為 PITC 柱前衍生法。采用紫外檢測時基線平穩(wěn)，衍生物的穩(wěn)定性較好，且衍生反應(yīng)時間對衍生效率影響不大，靈敏度可達100 pmol。當(dāng)采用熒光檢測時，靈敏度可達pg（fmol）水平，幾乎提高3 個數(shù)量級，但對流動相的純度要求較高，梯度洗脫會引起基線漂移；對檢測條件要求苛刻，氨基酸含量較低的樣品適宜采用熒光檢測法檢測。另外，液相色譜法分離測定氨基酸時常用氨基酸分析專用方法包，諸如Waters 公司開發(fā)的AccQ-Tag 試劑包法和Pico-Tag 試劑包法，配合優(yōu)化的溶劑洗脫條件及專用分析柱，使氨基酸在20 min內(nèi)得到高效分離，靈敏度可達0.5～1.0 pmol 級，一、二級氨基酸都能測定，衍生操作簡單，分析時間短。但是，因衍生試劑方法包價格較高而限制了其廣泛應(yīng)用。氨基酸的分離亦可采用普通的反相色譜法，如采用C18，C8柱或 BEH Amide 親水色譜柱[39]。

表1 柱前衍生高效液相色譜法分析氨基酸的衍生試劑及方法比較Table 1 Comparison of derivative reagents and methods for analysis of amino acids by High Performance Liquid Chromatography used pre-column derivatization

高效液相色譜柱前衍生化法通常無需考慮衍生反應(yīng)的動力學(xué)因素，但衍生存在衍生化試劑不穩(wěn)定、試劑干擾、耗時以及個別氨基酸衍生化困難等問題。因此，研究工作者紛紛開發(fā)無需衍生的液相色譜氨基酸分析方法。

2.4.2 未衍生法 蒸發(fā)光散射檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）是一種新型通用高效液相色譜檢測器。相比紫外或熒光檢測器，其響應(yīng)不受物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)的限制。由于ELSD 具有可以直接檢測無紫外、熒光特性物質(zhì)的優(yōu)點，所以尤其適用于未衍生氨基酸的直接檢測。王玉紅等[3]建立了一種采用反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（RHPLC-ELSD）直接測定20 種未衍生基本氨基酸的分析方法，并將其用于氨基酸注射液中氨基酸含量的測定，所得檢測結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性。

質(zhì)譜檢測器：LC-MS聯(lián)用技術(shù)能夠提取特征性離子，一般不需要對樣品進行完全的分離和衍生化前處理，對于樣品的分離度要求相對較低，方便、快速。隨著同位素稀釋質(zhì)譜法的應(yīng)用發(fā)展，氨基酸分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度得到了進一步的提高[40]。LC-MS 法應(yīng)用廣泛，如研究者采用LC-ESI-MS測定了藏藥中20種游離氨基酸含量[41]，此法靈敏度高、重現(xiàn)性較好，可檢測中藥材中痕量氨基酸，彌補HPLC 的缺陷。

隨著小顆粒填料和儀器耐壓等相關(guān)技術(shù)的進一步完善，超高壓液相色譜技術(shù)也日益廣泛應(yīng)用。世界第一個商品化超高效液相色譜系統(tǒng)于1996年問世后，便增加了色譜分析的通量及色譜峰容量。王星等[42]以中藥材天南星為研究對象，開發(fā)了中藥材中氨基類成分的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法，結(jié)果表明，此法可快速地對中藥中的氨基類成分進行定性分析。任浩等[43]建立了UPLC-TQ-MS（不需要柱前衍生）；同時測定銀杏花粉中24 種游離氨基酸含量的方法，所測的24 種氨基酸呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系和較好的加樣回收率。

3 結(jié)語與展望

中草藥成分十分復(fù)雜，目前對中草藥中氨基酸的分離分析方法研究已經(jīng)取得了一定進展，但每種方法各有利弊，分析方法優(yōu)劣評價需綜合考慮多種因素的影響。粗氨基酸樣品制備中微波水解法耗時短、能耗低，隨后80%乙醇純化法毒性小、污染低，是比較好的前處理方法；柱前衍生反相高效液相色譜分析法是目前應(yīng)用較多的一種氨基酸分析方法，此方法未來的發(fā)展將主要集中在選擇高穩(wěn)定、高靈敏的衍生試劑，使方法更趨靈敏、可靠。然而，衍生分析法需要衍生化操作，對衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性也需要考察，不利于直接、快速地測定氨基酸。無需衍生操作、適合大批次樣品檢測的高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法無需引入衍生步驟和干擾，在未來的一段時間內(nèi)將會有良好的應(yīng)用前景。