李海濤，劉艷環(huán)，苗利光※，張雪梅

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133000）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又稱面包酵母、出芽酵母，是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，也是發(fā)酵中最常用的生物種類。釀酒酵母在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上菌落為乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊，無性繁殖以芽殖為主。在生理特性方面，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和蔗糖，不能發(fā)酵蜜二糖[1]。近些年來，應(yīng)用于酵母菌分類的鑒定系統(tǒng)包括 Biolog、API20C、ATB32C、Vitek YBC 和 API Candida 系統(tǒng)。傳統(tǒng)的鑒定方法在鑒定過程中，由于生理生化特性可能會被某些因素改變，造成鑒定結(jié)果存在偏差[2]。隨著DNA 技術(shù)的發(fā)展，在酵母菌鑒定中的應(yīng)用越來越成熟。酵母基因大亞基26S rRNA 的D1/D2 可變區(qū)序列高度保守性[3-7]，可以應(yīng)用于酵母種的鑒定。

本研究采集吉林地區(qū)山葡萄產(chǎn)區(qū)的山葡萄和葡萄園土壤樣本18 份，經(jīng)實驗室分離、純化、微生物生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，成功分離出18 株酵母菌，其中有釀酒酵母12 株、發(fā)酵畢赤酵母3 株、乳酸克魯維酵母3 株，為后續(xù)釀酒酵母的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

從吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所野生山葡萄園（ZJ）、吉林市昌邑區(qū)左家鎮(zhèn)農(nóng)大紅山葡萄園（NDH）、通化市柳河縣青木原山葡萄基地（LH），分別采集成熟的山葡萄樣本和山葡萄園土壤樣本各3 份，樣本總計18 份，裝入無菌袋中常溫保存，立即進行實驗室菌種分離鑒定。

1.2 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)震蕩器（ZDP-250，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；微生物培養(yǎng)箱（DHP，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；生物安全柜（Thermo 1300 Series A2）、PCR 儀（Veriti）〔賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕；臺式冷凍離心機（5415R，德國艾本德股份公司）；凝膠電泳儀（Bio-Rad PowerPac HC）、紫外凝膠成像儀（Bio-Rad Gel DocTMXR+）（美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

麥芽汁培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；酵母粉、蛋白胨（英國Oxoid 公司）；酵母基因組DNA 提取試劑盒、LA-Taq DNA 聚合酶、DNA Maker〔寶生物工程（大連）有限公司〕；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 菌種的篩選

麥芽汁固體培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基131 g、瓊脂粉20 g，加蒸餾水至 1 L，121 ℃滅菌 30 min，然后倒入平板，冷卻后4℃保存?zhèn)溆?。YPD 液體培養(yǎng)基：2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，121℃滅菌30 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取每份山葡萄樣本10 g，置于無菌研缽中研磨，將山葡萄汁轉(zhuǎn)入100 mL 滅菌蒸餾水的三角燒瓶中充分振蕩15 min；稱取采集的土壤樣本每份1 g，加入至9 mL 的滅菌蒸餾水中，充分振蕩10 min，靜置5 min。分別10 倍梯度稀釋山葡萄汁水溶液和土壤水溶液至104、105，取稀釋液 100uL 涂布麥芽汁固體培養(yǎng)基平板，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長情況。

2.2 菌株的分離優(yōu)化

挑取麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中生長情況良好的單菌落，轉(zhuǎn)移至含有50 mL YPD 培養(yǎng)基的三角燒瓶中，12層紗布封口，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，測定細菌生長濃度OD600值。

2.3 菌株理化性質(zhì)鑒定

糖發(fā)酵實驗對分離的菌株進行理化性質(zhì)鑒定[8-10]。

2.4 酵母基因組的提取

取 1～2×108酵母菌的過夜培養(yǎng)液至 1.5mL 的Microtube 中，12 000 r/min 離心 1 min。棄去上清，加入500uL 的GenTLE Yeast Solution A，輕微振蕩重懸沉淀，37℃溫浴1 h，期間輕輕振蕩離心管數(shù)次。加入100uLGenTLE Yeast Solution B，輕微振蕩混勻，70 ℃溫浴10 min。加入200uLGenTLE Yeast Solution C，輕微振蕩混勻，冰浴5 min，12 000 r/min 4 ℃離心5 min。取上清于新的離心管中，加入1/2 體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，12 000 r/min 4℃離心5min，棄上清。加入500uL 預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒洗滌沉淀，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清。室溫下干燥，加入適量的TE Buffer 溶解，20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 特異性引物

上游引物：5'-GCTTAGTACGGCGAGTGAAG-3'

下游引物：5'-TGCTGGCCCAGTGAAATGC-3'

2.6 26SrRNA基因的擴增和測序

以提取的釀酒酵母基因組DNA為模板，采用26S rRNA D1/D2 區(qū)具有特異性的引物，進行26S rRNA的PCR 擴增。擴增反應(yīng)體系（50uL）：50 ng 酵母基因組DNA 模板、2uL dNTP mixture、上下游引物（終濃度0.25 mol/L）、0.5uL DNA Taq 聚合酶、5uL10×PCR Buffer。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min，30 個循環(huán)包括95 ℃變性 1 min，49 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸30 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。對獲得的酵母菌菌株26S rRNA D1/D2 基因進行測序，測序結(jié)果在NCBI 核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

3 結(jié)果

3.1 菌株篩選

在采集的各土壤和山葡萄樣本中均有圓潤、白色、整齊、形態(tài)較好的單菌落生長。

3.2 菌株的分離優(yōu)化

挑取其中生長良好的單菌落共計27 個菌落，轉(zhuǎn)入YPD 液體培養(yǎng)基中進行菌株分離優(yōu)化，測定24 h 和36 h 的生長速度，以O(shè)D600計算，結(jié)果見表1。其中，編號為ZJ-02、ZJ-06、NDH-01、NDH-05、NDH-09、LH-03、LH-05、LH-06 和 LH-08 共 9 株菌生長情況較差，后續(xù)研究將這9 株菌舍棄。

表1 酵母菌株的生長速度結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical properties of yeasts

3.3 菌株理化性質(zhì)鑒定

分離的18 株酵母菌都能對葡萄糖發(fā)酵，個別菌株對乳糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖有發(fā)酵，與分離優(yōu)化試驗中在YPD 培養(yǎng)基中利用葡萄糖作為碳源的生長狀況相一致。見表2。

表2 酵母菌株的理化性質(zhì)鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical properties of yeasts

3.4 基于26SrRNA D1/D2區(qū)的分子生物學(xué)鑒定

分離的18 株酵母菌26S rRNA D1/D2 區(qū)基因序列經(jīng)過PCR 克隆和測序后，在NCBI GeneBank 數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，依據(jù)分離株與標準株親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），并對分離株進行分類（表3）。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 1 Phylogenetic tree

表3 酵母菌的26S rRNA D1/D2 區(qū)序列鑒定結(jié)果Table3 The result of 26S rRNA D1/D2 sequence of yeast identification

4 結(jié)論

山葡萄作為釀酒原料已經(jīng)有70 多年的歷史[11-12]，酵母是釀酒工藝中最關(guān)鍵的因素之一[13-16]。本研究選擇的樣本采集地點位于吉林省內(nèi)山葡萄優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)和種植資源基地，種質(zhì)優(yōu)良、資源豐富。從采集的土壤和山葡萄樣本中經(jīng)過菌株的分離優(yōu)化、生理生化試驗和分子生物學(xué)鑒定，成功分離出18 株酵母菌，其中有釀酒酵母12 株、發(fā)酵畢赤酵母3 株、乳酸克魯維酵母3株；從樣本分布區(qū)域來看，分離出的釀酒酵母大多數(shù)為自然生長酵母菌，占本次分離結(jié)果的66.7%。為釀酒酵母菌株選育、飼料釀酒酵母產(chǎn)品、有機礦物元素酵母鐵酵母銅飼料添加劑產(chǎn)品的研究提供了充足的菌種資源。