任毅 趙泓 寇青禾 江姣 張海英 侯文菊 鄒小花 孫宏賀 宮國(guó)義 許勇

目的與意義：現(xiàn)代西瓜品種的遺傳基礎(chǔ)較窄，然而西瓜中有幾個(gè)亞種具有廣泛遺傳多樣性，它們可以成為改良西瓜品種的有用種質(zhì)資源。當(dāng)前西瓜基因組資源和遺傳圖譜有限，并需要開(kāi)發(fā)一種可用于鑒定西瓜染色體的細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜，其能夠劃定栽培西瓜與其它相關(guān)的西瓜屬植物之間存在的結(jié)構(gòu)差異?，F(xiàn)如今，還沒(méi)有任何關(guān)于西瓜基因組序列的高密度遺傳連鎖圖譜的報(bào)道，致使西瓜在不同品種之間遺傳多樣性較低。所以，構(gòu)建高密度的西瓜遺傳連鎖圖譜成為當(dāng)下之需。

材料與方法：使用栽培種‘97103和野生種‘PI 296341-FR雜交單粒傳構(gòu)建的103株系重組自交系（RILs）選擇96株。從栽培種‘97103基因組組裝scaffolds和野生種‘PI 296341-FR的基因組序列讀取來(lái)開(kāi)發(fā)SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列），InDel（插入缺失）和SV（結(jié)構(gòu)變異）標(biāo)記。利用栽培種‘97103和野生種‘PI 296341-FR構(gòu)建的103株RIL群體進(jìn)行遺傳作圖。使用JoinMap進(jìn)行圖譜的構(gòu)建，計(jì)算片段的重組率。利用細(xì)菌人工染色體（BAC），5S和45S rDNA探針，用于熒光原位雜交（FISH）。

結(jié)果與分析：SSR、InDel和SV標(biāo)記是基于栽培種‘97103組裝的353 M基因組scaffolds 序列和野生種‘PI 296341-FR的重測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的。研究中共鑒定了13 744個(gè)假設(shè)的SSR位點(diǎn)。在消除多種同源性的SSR基因后，選擇具有長(zhǎng)重復(fù)基序的1 877個(gè)特有SSR用于與RIL群體的親本系（‘97103和‘PI 296341-FR）的多態(tài)性分析。在1 877個(gè)SSR中，787個(gè)（41.9%）在PCR擴(kuò)增后顯示出栽培種‘97103和野生種‘PI 296341-FR之間的多態(tài)性。在僅選擇5～10 bp內(nèi)的InDel和120 bp至1 500 bp的SV，獲得3 759個(gè)InDel和584個(gè)SV。選擇InDels標(biāo)記303個(gè)和SV標(biāo)記54個(gè)用于2個(gè)RIL親本之間的多態(tài)性分析，結(jié)果顯示303個(gè)InDel標(biāo)記中的290個(gè)標(biāo)記和所有54個(gè)SV標(biāo)記在父母本之間是多態(tài)的。

偏分離普遍存在于遺傳作圖中，偏分離在植物基因組進(jìn)化中起著主導(dǎo)作用。在第1、2、3、4、5、7、8、9號(hào)和10號(hào)連鎖群（LGs）中分別檢測(cè)到9個(gè)偏分離熱點(diǎn)區(qū)域。在11個(gè)LGs中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)重組抑制區(qū)域，染色體末端的區(qū)域具有更高的重組率。熱點(diǎn)區(qū)域的重組率為3.0～8.3 cM·Mb-1，而抑制區(qū)域的重組率為0～0.9 cM·Mb-1，整個(gè)基因組的遺傳距離與物理距離的平均比值為2.3 cM·Mb-1。

成功錨定了234個(gè)scaffolds，總共330 Mb，占栽培種‘97103基因組被拼接的353 Mb的93.5%，而且，195個(gè)scaffolds至少被2個(gè)標(biāo)記所錨定。平均每個(gè)scaffolds 被4個(gè)標(biāo)記所定位，具有一個(gè)以上標(biāo)記的94個(gè)scaffolds可以在遺傳圖譜上確定方向。對(duì)于僅具有一個(gè)遺傳標(biāo)記或具有低重組頻率的基因組區(qū)域的140個(gè)較小scaffolds在圖譜上的定位尚不能確定方向，根據(jù)連鎖組命名編號(hào)將11條染色體進(jìn)行了scaffolds組裝。

測(cè)序了947個(gè)BAC克隆的兩端的序列，并獲得了一個(gè)共有1 664個(gè)高質(zhì)量的末端序列，這些序列和西瓜基因組scaffolds比對(duì)。將86個(gè)單拷貝BAC鑒定為FISH的候選探針，其中11個(gè)具有染色體特異性。還對(duì)有絲分裂染色體上的45S和5S rDNA位點(diǎn)進(jìn)行了FISH定位，以識(shí)別第4號(hào)染色體和第8號(hào)染色體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，栽培種‘97103基因組中有2個(gè)45S rDNA位點(diǎn)和一個(gè)5S rDNA位點(diǎn)。5S rDNA位點(diǎn)與第8號(hào)染色體上的一個(gè)45S rDNA位點(diǎn)同步，而另一個(gè)45S rDNA位點(diǎn)位于第4號(hào)染色體上。

利用來(lái)源于包括scaffolds錨定和定位全基因組測(cè)序以及重測(cè)序多態(tài)性SSR標(biāo)記，InDel標(biāo)記和SV標(biāo)記構(gòu)建了西瓜遺傳圖譜。這是第1個(gè)以組裝基因組為基礎(chǔ)的高密度西瓜基因圖譜。以高密度遺傳圖譜用作參考圖譜，用FISH分配連鎖群來(lái)匹配染色體，該圖譜為錨定和定向基因序列以及確認(rèn)目前基因組組裝的完整性提供了基礎(chǔ)。對(duì)未來(lái)的數(shù)量性狀基因（QTL）定位、分子標(biāo)記輔助育種和位置基因克隆很有價(jià)值。這些標(biāo)記被選擇出來(lái)后均勻分布在scaffolds 中（圖3），從而可以對(duì)整個(gè)基因組重組進(jìn)行更好地評(píng)估。發(fā)現(xiàn)9個(gè)偏分離熱點(diǎn)區(qū)域（SDRs）中的8個(gè)和Citrullus lanatus var. lanatus親本相關(guān)，這種偏離的可能是栽培親本中區(qū)域基因與果實(shí)和種子的產(chǎn)量有關(guān)。

鑒定了位于每個(gè)染色體中的基因組區(qū)間SNP和InDel數(shù)量在減少，表明這些區(qū)域可能具有較低的序列多樣性。在低SNP和InDels區(qū)域，鑒定出50和100個(gè)標(biāo)記，其平均重組率分別為0.6和0.9cM·Mb-1，與重組抑制區(qū)域速率（0.4 cM ·Mb-1）相似，低于全基因組重組率（2.3 cM·Mb-1）。這些標(biāo)記發(fā)生在重組抑制區(qū)域，意味著低序列多樣性區(qū)域與遺傳圖譜中鑒定的低重組區(qū)域重疊，它們可能位于著絲粒周邊區(qū)域。每個(gè)標(biāo)記都是從非重復(fù)scaffolds 序列設(shè)計(jì)的，理論上可以檢測(cè)整個(gè)基因組中的交叉。具有高SNP和InDel密度的區(qū)域富含重組活性染色體末端，表明它們位于端粒和富含基因的區(qū)域。

結(jié)? ? 論：利用由103株系重組自交系和228.3 Mb組裝序列組成的高密度遺傳圖譜，成功地錨定了234個(gè)Scaffords（占353Mb序列的93.5%），繪制出了第一個(gè)以基因組組裝為基礎(chǔ)的西瓜高密度遺傳圖譜。最近報(bào)道的幾種作物遺傳圖譜中組裝序列錨定和定位百分比顯示，可可（67%錨定，50%定位）;蘋(píng)果（88%，66%）;葡萄（69%，61%）;草莓（94%錨定）;大豆（97%錨定）;黃瓜（72.8%錨定），與此相比較，西瓜中scaffolds錨定的比例（93.5%）很高，而定位序列（65%）所占的比例并不高，但與其他作物中所報(bào)道的定位程度相似。高密度西瓜遺傳圖譜反映了整個(gè)基因組scaffolds序列的整合，將有助于重要基因的定位克隆、QTL的鑒定和標(biāo)記輔助選擇（MAS），對(duì)西瓜育種有很大幫助。