朱華玉 宋芃垚 郭祿芹 李嚴(yán)曼 孫守如 楊路明

目的與意義： 隨著新一代全基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的物種開發(fā)了大量的覆蓋全基因組的SSR標(biāo)記。雖然在西瓜上也開發(fā)了一些SSR標(biāo)記，并已經(jīng)在連鎖圖譜和遺傳多樣性研究中得到應(yīng)用，但仍存在多態(tài)性低、基因組覆蓋率低等問題。本研究從西瓜全基因組水平分析了不同類型SSR序列的分布及頻率。并開發(fā)了覆蓋全基因組的SSR標(biāo)記，同時(shí)通過電子 PCR的方法確定了在甜瓜、黃瓜中通用的SSR分子標(biāo)記，并利用這些通用SSR標(biāo)記進(jìn)一步明確了西瓜與黃瓜以及甜瓜3個(gè)物種之間的染色體共線性關(guān)系。本研究同時(shí)篩選了32對高多態(tài)性SSR標(biāo)記對134份西瓜材料進(jìn)行了遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析。

材料與方法： 利用西瓜全基因組序列（http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi），用MISA（Microsatellite identification tool） 軟件識別SSR序列。用Primer3 （v. 1.1.4）進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)。將西瓜全基因組SSR標(biāo)記通過perl語言編寫的腳本，利用BLAST分別在黃瓜和甜瓜基因組中進(jìn)行電子PCR分析。西瓜、甜瓜、黃瓜之間染色體的共線性用 Circos software v 0.55 （http：//circos.ca）分析。并利用熒光原位雜交（FISH）驗(yàn)證染色體之間的共線性。選取134份西瓜材料提取基因組DNA，利用西瓜SSR標(biāo)記和GeneAlEx 6.5、MEGA5、STRUCTURE2.3軟件進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。

結(jié)果與分析： （1）對東亞栽培型西瓜‘97103的353.5 Mb序列分析，共得到39 523個(gè)SSR位點(diǎn)。所有SSR的總長度占西瓜基因組草圖全長的0.28%，平均為111個(gè)/Mb 。在不同個(gè)數(shù)的核苷酸重復(fù)類型中，SSR出現(xiàn)的頻率與核苷酸基數(shù)呈負(fù)相關(guān)。SSR出現(xiàn)的頻率隨著重復(fù)單元數(shù)量的增加而減少，與SSR重復(fù)單元的長度之間的關(guān)系尤為明顯。統(tǒng)計(jì)了每種SSR序列的核苷酸組成，發(fā)現(xiàn)AT、AAT、AAAT、AAAAT、AAAAAT、AAAAAAT和AAAAAAAT是每個(gè)重復(fù)類型中最豐富的重復(fù)基序。研究了每條西瓜染色體上SSR類型的頻率和分布，發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)的頻率與染色體大小無關(guān)。（2）為了確定西瓜SSR標(biāo)記在葫蘆科不同物種間的應(yīng)用，利用黃瓜和甜瓜的基因組序列作為模板，用西瓜全基因組SSR標(biāo)記進(jìn)行電子 PCR分析。在西瓜和黃瓜間通用的標(biāo)記共891個(gè)，覆蓋黃瓜基因組190.42 Mb，占黃瓜基因組全長的98.87%，平均每條黃瓜染色體上有119個(gè)標(biāo)記。西瓜和甜瓜中的通用標(biāo)記共969個(gè)，覆蓋甜瓜基因組的310.94 Mb，占甜瓜基因組全長的98.29%，平均每條甜瓜染色體上有72個(gè)標(biāo)記。在黃瓜、甜瓜、西瓜3個(gè)物種中都通用的SSR標(biāo)記有448個(gè)，其在西瓜染色體上的分布見圖3。對西瓜的448個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行電子PCR分析，將其產(chǎn)物利用EST、unigenes和CDS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，其中在EST數(shù)據(jù)庫中可以檢測到21個(gè)SSR標(biāo)記，19個(gè)SSR標(biāo)記在unigene數(shù)據(jù)庫中表達(dá)，其中210個(gè)位于編碼區(qū)表明這些SSR標(biāo)記與基因功能相關(guān)。（3）根據(jù)通用標(biāo)記在黃瓜和西瓜對應(yīng)的染色體上的位置，對兩個(gè)物種染色體之間的共線性關(guān)系進(jìn)行推斷。西瓜和黃瓜之間的染色體共線性關(guān)系相對復(fù)雜，詳見表3。根據(jù)通用SSR標(biāo)記在兩個(gè)物種基因組上的位置，可以將西瓜的染色體分為不同的區(qū)段，平均每個(gè)區(qū)段至少有3個(gè)SSR標(biāo)記。在明顯區(qū)分的84個(gè)區(qū)段內(nèi)，有44個(gè)與黃瓜的染色體有較好的共線性，其余的40個(gè)在兩者之間有倒位現(xiàn)象。將西瓜與甜瓜之間做了類似的比較，在925個(gè)通用的SSR標(biāo)記中有850個(gè)可用于兩者染色體共線性的分析。盡管西瓜和甜瓜具有相似的染色體數(shù)目，但他們?nèi)旧w之間的線性關(guān)系非常復(fù)雜。為了更直觀地了解葫蘆科植物的染色體之間的進(jìn)化關(guān)系，以西瓜染色體為背景，對黃瓜和甜瓜的染色體進(jìn)行重組作圖。該圖很好地解析了葫蘆科3個(gè)物種之間的染色體共線性關(guān)系。進(jìn)一步利用原位雜交（FISH）的方法對基于SSR標(biāo)記的染色體線性關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證。熒光原位雜交的結(jié)果與利用SSR標(biāo)記的比較作圖結(jié)果完全一致。（4）選擇分布于西瓜11條染色體上的32對多態(tài)性好的SSR標(biāo)記進(jìn)行西瓜遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示32個(gè)SSR標(biāo)記在134份材料中的多態(tài)性表現(xiàn)良好。遺傳多樣性分析和群體結(jié)構(gòu)分析都將134份種質(zhì)分為2個(gè)類群，結(jié)果幾乎完全一致。從同一大陸收集的種質(zhì)并不完全聚為一類，表明西瓜已經(jīng)發(fā)生了不同的程度遷移和大陸之間的相互交流。

結(jié)? ? 論：本研究基于西瓜全基因組序列對各種SSR重復(fù)基序的頻率和分布等特征進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并開發(fā)了覆蓋西瓜全基因組的SSR標(biāo)記。通過電子PCR的方法，對在西瓜、黃瓜、甜瓜3個(gè)物種間通用性SSR標(biāo)記進(jìn)行了篩選，這些標(biāo)記為更準(zhǔn)確地揭示三者基因組之間的共線性關(guān)系提供了充足的標(biāo)記來源。此外，利用32對高多態(tài)性引物對134份材料進(jìn)行聚類和群體結(jié)構(gòu)分析，兩種分析結(jié)果高度一致。本研究開發(fā)了大量的SSR分子標(biāo)記和跨種間通用SSR標(biāo)記，這些標(biāo)記將會(huì)在圖譜構(gòu)建、基因定位、比較作圖和分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域得到大量應(yīng)用，同時(shí)也可為葫蘆科其他未完成測序物種提供重要的標(biāo)記資源。