王芳 劉秀杰 劉繼秀 高美玲

摘? ? 要：為明確齊齊哈爾市郊區(qū)西瓜繁育基地西瓜幼苗猝倒的發(fā)病原因及為西瓜苗期病害防治提供依據(jù)，從發(fā)病區(qū)采集病樣進行病原鑒定。結(jié)果分離獲得12個菌株，根據(jù)培養(yǎng)特征和形態(tài)學(xué)特征，確定分離到的菌株為尖孢鐮刀菌（Fusaruim oxysporum）;利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增菌株rDNA-ITS序列，GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST同源比對與F. oxysporum一致性達99%。將分離到的菌株回接到健康西瓜幼苗上，植株表現(xiàn)出與田間相似發(fā)病癥狀?；谛螒B(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及致病性檢測，最終確定齊齊哈爾市郊區(qū)育苗基地西瓜猝倒病的病原菌為Fusaruim oxysporum。

關(guān)鍵詞：西瓜猝倒病;鐮刀菌;形態(tài)學(xué)特征;rDNA- ITS

Abstract：Watermelon seedlings with damping off symptom was found in Qiqihar suburban breeding base. In order to identify the cause of disease， samples were collected from the diseased area. A total of 12 strains were isolated and identified as Fusaruim oxysporum according to the characteristics of culture and morphology. The sequence of rDNA-ITS was amplified using primers ITS1/ITS4， and BLAST homologous alignment in GenBank database was 99% consistent with that of F. oxysporum The isolated strains were inoculated to healthy watermelon seedlings and the plants showed symptoms similar to those in the field. Based on morphology， molecular biology and pathogenicity detection， Fusaruim oxysporum was identified as the pathogen of watermelon damping off in Qiqihar city suburban breeding base.

Key words：Watermelon damping off; Fusaruim oxysporum; Morphological features; rDNA- ITS

西瓜是人們夏季消熱解暑的主要水果之一，在黑龍江省齊齊哈爾地區(qū)已有上百年的種植歷史，市下轄的每個區(qū)、縣幾乎都有西瓜栽培，種植方式主要以育苗移栽為主。由于育苗期間苗床土壤低溫、高濕，幼苗處于易感病階段，利于病菌侵入，加之苗床管理不當(dāng)，易發(fā)生病害。

猝倒病是作物苗期的主要病害之一，可由多種土傳病菌和種傳病菌真菌侵染引起，如絲核菌屬（Rhizoctonia）、鐮刀菌屬（Fusarium）、腐霉屬（Pythium）、疫霉屬（Phytophthora）等[1-5]。該病害也是西瓜苗期常見病害，但關(guān)于該病害的研究及報道相對較少。2012年，曾蓉等[6]從上海金山區(qū)的西瓜幼苗猝倒樣本中分離到腐霉（Pythium spp.）。葉愛華[7-8]報道瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum（Edson）Fitzp]和德里腐霉（Pythium deliense Meurs）均可引起西瓜猝倒，并也能引起大棚菠菜幼苗猝倒。

2018年5月，黑龍江省齊齊哈爾市郊區(qū)西瓜繁育基地發(fā)現(xiàn)西瓜幼苗猝倒，發(fā)病率達30%。受害幼苗莖基部呈黃褐色水漬狀病斑，后期倒伏、枯死，導(dǎo)致移栽苗數(shù)不夠，西瓜成熟期不一致，影響生產(chǎn)。為明確西瓜猝倒病的病因，筆者對該地區(qū)西瓜幼苗猝倒病的分離純化菌進行形態(tài)學(xué)和分子鑒定，以及致病性測定，旨在明確西瓜猝倒病病原菌的主要種類，為該病害的防治及抗病育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病株采集

2018年5月，對黑龍江省齊齊哈爾市郊區(qū)西瓜繁育基地進行西瓜幼苗猝倒病發(fā)病癥狀的觀察及取樣，調(diào)查包括病斑顏色、大小、部位和發(fā)病率。

1.2 病原菌分離與純化

參照方中達組織分離法進行病原菌分離[9]。將患病幼苗先用流水沖洗，在植株病健交界處剪取3～5 mm根段數(shù)塊，然后用70%的乙醇表面消毒30 s，放入無菌水中連續(xù)清洗3次，接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)。5 d后觀察并記錄分離物的類別和出現(xiàn)率。選取菌絲邊緣接種到新的PDA平板上純化培養(yǎng)，將純化的菌株接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)特征鑒定

從純化的病原菌培養(yǎng)基上，挑取菌絲邊緣置于新的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，十字交叉法測量菌落生長直徑，觀察菌落形態(tài)、色素顏色、菌落生長速率及邊緣生長情況。隨機選大、小分生孢子各50個測量大小，顯微鏡下鏡檢大、小分生孢子、厚垣孢子及分生孢子梗的的形狀及著生方式。根據(jù)BOOTH [10]分類系統(tǒng)進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

供試菌株接種在PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，取 0.2 g菌絲體，加入液氮研磨，采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取病原菌基因組DNA。經(jīng)1%凝膠電泳檢測合格后，將其作為ITS區(qū)DNA擴增的模板。ITS區(qū)序列PCR擴增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），預(yù)計分別擴增約540 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括：DNA模板1 μL，2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol·L ITS1 1 μL，10 μmol·L ITS 4 μL，dd H2O補至25 μL。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進行35個擴增循環(huán)即 95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增后的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.5 病原菌致病性測定

采用浸根法對代表分離菌株進行回接。先將西瓜種子用5%的NaClO溶液消毒10 min，55 ℃溫湯浸種后，置25 ℃溫箱催芽。待種子發(fā)芽并長到3～5 cm時將發(fā)芽種子移入小燒杯內(nèi)，注入孢子懸浮液（濃度為1.0×106 個·mL），浸根時間為30 min，以清水作為對照。3次重復(fù)，每次重復(fù)5株。接種后，幼苗轉(zhuǎn)入25～27 ℃溫室培養(yǎng)。14 d后調(diào)查病害發(fā)生情況，并進行病原菌的重新分離及鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

西瓜猝倒病發(fā)生在幼苗出土至真葉展開時期，發(fā)病率在30%左右。幼苗出土后，葉片仍保持綠色時就出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象。取出病株可見莖基部或根部呈黃褐色水漬狀病斑，后期莖基部呈縊縮（圖1）。

2.2 病原菌形態(tài)鑒定

觀察PDA平板正面，菌落呈白色，菌絲生長茂盛、密集，平均每天生長0.8 cm，氣生菌絲絨毛狀;培養(yǎng)基背面呈橙黃色，基物無色。小型分生孢子較多，橢圓形或腎形，0～2個隔膜，假頭狀著生在產(chǎn)孢細胞上，大小為（3.8～11.1） μm×（1.0～3.0） μm;大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，3～4個隔膜居多，大小為（12.5～37.0） μm×（2.3～5.0） μm;厚垣孢子球形，單生或串生（圖2）。這些形態(tài)特征與Booth的鐮刀菌分類系統(tǒng)中尖孢鐮刀菌的形態(tài)特征基本一致，初步將具有這些形態(tài)特征的分離物鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusaruim oxysporum）。

2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

提取代表菌株XG1-1基因組DNA，利用真菌通用引物ITS1/ ITS4 PCR擴增rDNA-ITS序列，擴增序列片段大小分別為541 bp。在GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行BLAST比對分析，代表菌株XG1-1的ITS序列與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的相似性達99%（Genbank 登錄號JF807397）。根據(jù)供試菌株形態(tài)學(xué)特征及rDNA-ITS序列分析結(jié)果，將該菌株鑒定為尖孢鐮刀菌。

2.4 病原菌致病性測定

采用浸根法將分離物接種到西瓜幼苗根部。接種14 d后，發(fā)現(xiàn)幼苗子葉完好，但近地面處的莖基部或根莖部呈現(xiàn)出黃色至黃褐色水漬狀縊縮病斑，大多數(shù)幼苗呈現(xiàn)倒伏現(xiàn)象，與田間發(fā)病癥狀一致。取病健交界組織，進行病原菌分離，得到分離物與接種菌株形態(tài)相同，證明所接菌株為西瓜猝倒病的病原菌。

3 討論與結(jié)論

猝倒病是西瓜苗期常見病害之一，而病原學(xué)研究是防治病害的基礎(chǔ)，關(guān)于其病原鑒定的報道相對較少。已報道的病原菌有瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）和德里腐霉（Pythium deliense）。筆者從齊齊哈爾市郊區(qū)西瓜繁育基地的西瓜幼苗中分離到致病菌尖孢鐮刀菌F. oxysporum，致病性測定表明這種鐮刀菌也可侵染甜瓜幼苗。

尖孢鐮刀菌是一種土壤習(xí)居菌，既可以單獨侵染植物，也可以與其他鐮刀菌或其他病原菌共同作用混合侵染植物。該病原菌寄主范圍廣，可侵染松苗及棉花苗使幼苗猝倒;可危害成株期的西瓜及煙草、白菜、玉米等多種作物致使根腐或枯萎[11-15]。以往研究中，鐮刀菌屬病原菌的分類主要依據(jù)形態(tài)特征劃分，但分子生物技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展為一些形態(tài)相近的姊妹種和復(fù)合種的準(zhǔn)確區(qū)分提供了可能，如 F. oxysporum Schlecht. ex Snyder et Hansen、F. solani （Martius） Appel et Wollenw. ex Snyder et Hansen、F. graminearum Schwabe等已被區(qū)分[16]。筆者利用形態(tài)學(xué)及DNA序列分析技術(shù)，并結(jié)合致病性檢測，明確引起齊齊哈爾市西瓜育種基地幼苗猝倒病病原菌為尖孢鐮刀菌，為西瓜苗期病害防控提供了理論依據(jù)。

參考文獻

[1] KIM M J，SHIM C K，KIM Y K，et al.Evaluation of watermelon germplasm for resistance to Phytophthora blight caused by Phytophthora capsici[J].The Plant Pathology Journal，2013，29（1）：87-92.

[2] HALLA M R，SUMMERA D R. Influence of cultivar and primed or germinated seed on stand establishment of watermelon in soil infested with Pythium irregulare or Rhizoctonia solani AG-4[J].Crop Protection，1994，13（6）：443-450.

[3] BHARATH B G， LOKESH S，RAGHAVENDRA V B，et al.First report of the ocurrence of Myrothecium verrucaria in watermelon seeds from India[J].Australasian Plant Disease Note，2006，1：3-4.

[4] ZHAO B X，YAN J F，ZHANG S.Phylogeny and pathogenicity of Fusarium spp. isolated from greenhouse melon soil in Liaoning Province[J].Saudi Journal of Biological Sciences，2014，21（4）：374-379.

[5] 梁慎，徐小利，趙衛(wèi)星，等.河南省一例西瓜死苗現(xiàn)象的病原鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，43（1）：84-88.

[6] 曾蓉，陸金平，宋榮浩，等.西瓜苗期病害病原初步鑒定[C]//中國植物病理學(xué)會，2012年學(xué)術(shù)年會論文集.

[7] 葉愛華.西瓜猝倒病的綜合防治技術(shù)[J].現(xiàn)代園藝，2016，3：122-123.

[8] 銀玲，京山幸二，田迅，等.內(nèi)蒙古地區(qū)菠菜猝倒病病原菌鑒定[J].中國蔬菜，2016（11）：50-55.

[9] 方中達.植病研究法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版，1998.

[10] BOOTH C.鐮刀菌屬[M].陳其瑛，譯.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988：12-18.

[11] 耿麗華， 郭紹貴，張海英，等.西瓜根腐病菌的生物學(xué)特性[J].中國蔬菜，2010（18）：60-63.

[12] 霍憲起.湖北省濕地松猝倒病病原菌及其生防細菌的初步研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[13] 侯明生，黃俊斌.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2006：116-118.

[14] 吳安忠，程崖芝，巫升鑫，等.煙草鐮刀菌根腐病的病原鑒定[J].中國煙草學(xué)報， 2017，24（2）：135-140.

[15] 閆文學(xué)，石延霞，李盼亮，等.大白菜枯萎病病原鐮刀菌種類的初步研究[J].植物病理學(xué)報，2018，48（5）：587-593.

[16] 呂國忠.植物病原菌物學(xué)：不能拋棄的形態(tài)分類與不能拒絕的分子分析[J].菌物學(xué)報，2012，31（4）：461-464.