宋秀道，毛晨梅，馬錦

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 藥劑科，江蘇 蘇州 215025）

白楊素是黃芩、南棗酸及木蝴蝶等中藥的活性成分，也是一種廣泛存在于蜂膠、蜂蜜、西番蓮藍(lán)莓及其他膳食植物提取物中的黃酮類化合物，具有多種藥理作用，且不良反應(yīng)小，毒性低[1]。在多種腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物腫瘤模型中，白楊素具有抗腫瘤與化療增敏作用[2-3]。本研究通過白楊素增強(qiáng)5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，提高5-FU 化療的敏感性，減少5-FU 的使用量與毒副反應(yīng)，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 人肝癌Bel-7402 細(xì)胞株由蘇州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈(zèng)，白楊素（純度99%）和5-FU（純度99%）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司，MTT 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、二甲基亞砜（dimethylsurfoxide,DMSO）、胎牛血清及β-actin 單克隆抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，0.25%胰蛋白酶液購(gòu)自上海閃晶生物公司，Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，碘化丙啶（propidium iodide,PI）染液購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）裂解液購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司，ECL Plus 超敏發(fā)光液購(gòu)自北京Solarbio 公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CMCTAG 公司，B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）、Bcl-2 相關(guān)死亡啟動(dòng)因子（Bcl-2 associated death promoter,Bad）及半胱氨酸蛋白酶蛋白-3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司。

1.1.2 儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（550 型）和垂直電泳儀（Mini-P3）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，MoFlo XDP型超速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，DYCZ-40B 型轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京六一儀器廠，Centrifuge 5810R 冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，AlphaImager HP 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ProteinSimple 公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力人肝癌Bel-7402 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于5%二氧化碳CO2、37℃飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌Bel-7402 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度并接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1.2×104～1.5×104個(gè)/孔），于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100μl 白楊素的培養(yǎng)基（終濃度為100μmol/L），空白對(duì)照組不加藥；培養(yǎng)24 h 后，吸出培養(yǎng)液后，加入含5-FU 終濃度為0.0、12.5、25.0 及50.0μg/ml 培養(yǎng)基作用48 h，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。每組依次加入白楊素終濃度為50、100、150、200 及250μmol/L 的培養(yǎng)基作用48 h，空白對(duì)照組不加藥。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄上清液，每孔加入150μl DMSO，震蕩10 min 以使結(jié)晶物充分溶解，測(cè)定490 nm 處吸光度（optical density,OD）值。計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照組OD×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌Bel-7402 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105～2×105個(gè)/ml，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2 ml/孔。于恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜后，加入含100μmol/L 白楊素培養(yǎng)基（空白對(duì)照組為正常培養(yǎng)基）作用24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入25μg/ml 5-FU作用48 h；然后用0.25%胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化收集細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）漂洗2 遍。設(shè)立白楊素單獨(dú)組（100μmol/L 白楊素）、5-FU 單獨(dú)組（25μmol/L 5-FU）、白楊素聯(lián)合5-FU組（100μmol/L 白楊素+25μmol/L 5-FU）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：先加105μl 含Annexin V-FITC 的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，混勻后室溫避光染色10 min，再加5μl PI 染液，室溫避光染色5 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm/530 nm），獲得細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞周期檢測(cè)：流式管內(nèi)緩慢加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇，重新懸浮細(xì)胞，避光30 min，4℃條件下PBS 洗滌后以1 000 r/min 離心5 min，加入500μl PI 工作液，室溫避光30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，獲得各組細(xì)胞有關(guān)增殖周期時(shí)相的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌Bel-7402 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2 ml/孔，于恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜后，加入含100μmol/L 白楊素培養(yǎng)基（對(duì)照組為正常培養(yǎng)基）作用24 h 后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入25μg/ml 5-FU 作用48 h；然后用0.25%胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，冷PBS 漂洗1 遍，收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞加入1 mmol/L PMSF裂解液100μl，吹打均勻置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min 離心30 min，取蛋白上清液，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，剩余蛋白與上樣緩沖液按比例混勻，沸水浴5 min，-80℃保存。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行蛋白分離，4℃條件下轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入一抗，4℃搖床孵育過夜。TBST 洗滌4 次，加入相應(yīng)的二抗，孵育2 h 后，TBST 洗4 次，ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，成像系統(tǒng)照相，用Image-J 軟件進(jìn)行圖片分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或析因設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Turkey's 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素增強(qiáng)5-FU 對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力的抑制作用

MTT 法篩選實(shí)驗(yàn)顯示，白楊素在0、50、100、150、200 及250μmol/L 濃度下作用肝癌BEL-7402 細(xì)胞48 h，細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.000）%、（92.982± 5.313）%、（82.261±7.793）%、（62.423±6.082）%、（50.022±5.454）%和（42.372±4.564）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.724，P=0.000）；白楊素濃度為100、150、200 及250μmol/L 時(shí)肝癌BEL-7402 細(xì)胞的存活率低于空白對(duì)照組（0μmol/L 白楊素）（P＜0.05）。見圖1。

將100μmol/L 白楊素預(yù)處理人肝癌Bel-7402細(xì)胞24 h 后不出現(xiàn)細(xì)胞活力抑制作用的劑量用于研究白楊素對(duì)5-FU 誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡是否有增強(qiáng)作用。各組細(xì)胞存活率比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，處理因素白楊素的主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=159.124，P=0.000）；處理因素5-FU 的主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.933，P=0.000）；兩者交互作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.768，P=0.0756）。無論是否進(jìn)行白楊素預(yù)處理，人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力隨5-FU 濃度增加而降低。100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h 能增強(qiáng)5-FU 對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力的抑制作用。見表1和圖2。

圖1 不同濃度白楊素作用人肝癌Bel-7402 細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞活力 （±s）

表1 兩組不同濃度人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力的抑制作用 （n =3，%，±s）

表1 兩組不同濃度人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力的抑制作用 （n =3，%，±s）

注：①與0.0μg/ml 5-FU 比較，P ＜0.05；②與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 0.0μg/ml 5-FU 12.5μg/ml 5-FU 25.0μg/ml 5-FU 50.0μg/ml 5-FU空白對(duì)照組 100.000±0.000 88.983±1.414 71.442±2.014① 50.224±5.323①100μmol/L 白楊素組 90.694±4.426 71.644±3.816①② 47.116±6.117①② 34.214±7.637①②

圖2 兩組不同濃度5-FU 作用人肝癌Bel-7402 細(xì)胞的 存活率比較 （±s）

2.2 白楊素增強(qiáng)5-FU 對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（4.15±0.88）%、白楊素單獨(dú)組為（13.32±1.33）%、5-FU 單獨(dú)組為（22.98±4.32）%，白楊素聯(lián)合5-FU組為（45.22±5.65）%。各組細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.234，P=0.000）；5-FU 單獨(dú)組細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組高（P＜0.05）；白楊素單獨(dú)組與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；白楊素聯(lián)合5-FU組細(xì)胞凋亡率較5-FU 單獨(dú)組和白楊素單獨(dú)組高（P＜0.05）。100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h 可增強(qiáng)5-FU 誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡的作用。見 圖3、4。

2.3 白楊素增強(qiáng)5-FU 對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞G2/M 期阻滯的誘導(dǎo)作用

圖3 各組流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

圖4 各組細(xì)胞凋亡率比較 （±s）

用PI 單染法檢測(cè)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞周期分布情況，空白對(duì)照組[G0/G1 期：（85.35±2.61）%，G2/M 期：（3.66±0.68）%]；白楊素單獨(dú)組[（G0/G1期：（80.92±4.34）%，G2/M 期：（8.06±1.05）%]；5-FU 單獨(dú)組[（G0/G1 期：（73.54±5.49）%，G2/M 期：（12.67±2.28）%]；白楊素聯(lián)合5-FU組[（G0/G1 期：（55.47±3.69）%，G2/M 期：（26.16±2.17）%]。各組人肝癌Bel-7402 細(xì)胞G0/G1 期細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，處理因素白楊素主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.012，P=0.000）；處理因素5-FU 主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.881，P=0.0016）；兩者交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.042，P=0.022）。各組細(xì)胞G2/M 期細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析，處理因素白楊素的主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=192.212，P=0.000）；處理因素5-FU 的主效應(yīng)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=83.693，P=0.000）；兩者交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.610，P=0.0016）。100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h 可增強(qiáng)5-FU 對(duì)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞發(fā)生G2/M 期阻滯。見圖5、6。

圖5 各組人肝癌Bel-7402 細(xì)胞周期分布情況

圖6 各組人肝癌Bel-7402 細(xì)胞G2/M 期的阻滯誘導(dǎo)作用比較 （±s）

2.4 白楊素對(duì)5-FU 處理人肝癌Bel-7402 細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；白楊素聯(lián)合5-FU組Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較白楊素單獨(dú)組和5-FU 單獨(dú)組低（P＜0.05），白楊素聯(lián)合5-FU組Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量較白楊素單獨(dú)組和5-FU單獨(dú)組高（P＜0.05）。Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 表達(dá)增強(qiáng)或減弱可能是白楊素預(yù)處理24 h 加強(qiáng)5-FU 誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制之一。見表2和圖7。

表2 各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)情況 （±s）

表2 各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)情況 （±s）

組別 Bcl-2 Bax Bad Cleaved Caspase-3空白對(duì)照組 0.924±0.13 0.632±0.072 0.142±0.011 0.363±0.032白楊素單獨(dú)組 0.893±0.091 0.613±0.083 0.453±0.062 0.344±0.041 5-FU 單獨(dú)組 0.284±0.032 0.921±0.11 0.62±0.051 0.652±0.053白楊素聯(lián)合5-FU組 0.127±0.012 1.132±0.092 0.933±0.124 0.792±0.034 F 值 77.122 22.753 59.574 87.425 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖7 各組Bcl-2、Bax、Bad 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

3 討論

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，位于癌癥相關(guān)致死率的第2 位[4]。早期HCC 患者治療以手術(shù)切除和肝臟移植輔以化療為主，一般可取得滿意療效；但對(duì)于手術(shù)后復(fù)發(fā)、晚期有轉(zhuǎn)移及不能耐受手術(shù)的患者，化療已成為其治療主要手段[5]。5-FU 是臨床用于肝癌化療的一線藥物。在過去的20年中，5-FU 臨床療效肯定，但長(zhǎng)期大劑量使用5-FU 產(chǎn)生的不良反應(yīng)和耐藥性已影響其臨床療效，阻礙其進(jìn)一步應(yīng) 用[6-7]。因此，目前迫切的任務(wù)是尋找新的化合物來增強(qiáng)其化療敏感性，為臨床解決腫瘤耐藥性提供治療 方案。

誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡是現(xiàn)代癌癥治療的主要目標(biāo)之一。5-FU 等化療藥物發(fā)揮化療藥物毒性的最初作用形式是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而細(xì)胞凋亡途徑異常是5-FU 發(fā)生耐藥的重要機(jī)制之一[8]。一般在臨床腫瘤化療中，為克服耐藥對(duì)化療效果的影響，提倡聯(lián)合用藥。流行病學(xué)研究證明，大量黃酮類化合物的攝入會(huì)降低多種腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。黃酮類化合物因而被認(rèn)為可用于腫瘤預(yù)防或臨床與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用。白楊素作為一種具有良好臨床應(yīng)用前景的天然黃酮類化合物，已被證實(shí)可直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。近年來研究也報(bào)道，白楊素可與阿霉素[12]、順鉑[13]等不同化療藥物協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h，人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力、凋亡和周期分布情況未受到影響。該濃度下的白楊素預(yù)處理24 h 可增強(qiáng)5-FU 抑制人肝癌Bel-7402細(xì)胞活力的作用，且100μmol/L 白楊素預(yù)處理人肝癌Bel-7402 細(xì) 胞24 h 后與12.5 和25.0μg/ml 5-FU聯(lián)用，人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力抑制效果分別優(yōu)于25 和50μg/ml 5-FU 單用，表明白楊素與5-FU 聯(lián)用的體外抑制人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力具有協(xié)同效應(yīng)。100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h 可增強(qiáng)5-FU 誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞凋亡的作用。細(xì)胞周期G2/M 期轉(zhuǎn)換在細(xì)胞周期進(jìn)展及凋亡啟動(dòng)中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h 可增強(qiáng)5-FU誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞G2/M 期阻滯的作用，影響DNA 復(fù)制，使癌細(xì)胞分裂受阻，從而抑制細(xì)胞增殖。因此，白楊素可提高化療藥物5-FU 促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，具有作為化療增敏劑的應(yīng)用前景。

目前細(xì)胞凋亡因啟動(dòng)階段的不同可分為內(nèi)源性線粒體通路和外源性死亡受體通路。Bcl-2家族基因是線粒體凋亡途徑的重要調(diào)控因子，通過調(diào)控線粒體膜的通透性，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C 到胞質(zhì)，啟動(dòng)Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如激活下游的凋亡效應(yīng)因子Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[14-15]。Bcl-2 高表達(dá)時(shí)，Bcl-2 可與Bax 形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡；Bax 或Bad 高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)敏感可促發(fā)細(xì)胞凋亡過程。肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中Bcl-2家族抑凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax與Bad等表達(dá)異常，從而打破體內(nèi)凋亡/抗凋亡的平衡，抑制多種化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與肝癌對(duì)化療的耐藥發(fā)生有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100μmol/L 白楊素預(yù)處理24 h 可使5-FU 誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402 細(xì)胞Cleaved Caspase-3、Bax 及Bad 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，人肝癌Bcl-2 蛋白表達(dá)水平下調(diào)，表明白楊素預(yù)處理后，5-FU 誘導(dǎo)的人肝癌Bel-7402 細(xì)胞線粒體凋亡途徑更為活躍，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。白楊素對(duì)5-FU 誘導(dǎo)Bel-7402 細(xì)胞凋亡的增敏作用是否還與外源性死亡受體通路有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，白楊素可增強(qiáng)5-FU 抑制人肝癌Bel-7402 細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)與上調(diào)Bax 和Bad 蛋白表達(dá)使線粒體凋亡通路激活可能是其重要的分子機(jī)制之一。白楊素對(duì)Bcl-2家族表達(dá)水平的調(diào)控是否與核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、非編碼RNA（microRNA）等有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。此外，筆者也將進(jìn)一步研究白楊素是否能影響人肝癌Bel-7402 細(xì)胞對(duì)5-FU 的化療敏感性。