張明明，劉欣躍，牟斌，王愛勤

(1.蘭州大學第二醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省粘土礦物應用研究重點實驗室，中國科學院蘭州化學物理研究所生態(tài)材料與綠色化學中心，甘肅 蘭州 730000)

近年來，由于對抗生素的濫用和不合理使用，導致耐藥菌株大量出現(xiàn)出現(xiàn)，嚴重威脅人類健康，因此急需研發(fā)新型抗生素[1-3].但是，新型抗生素的研發(fā)速度遠遠慢于細菌耐藥的發(fā)生速度.因此，研發(fā)具有高效抗菌活性的抗菌材料受到廣泛關(guān)注和研究.

目前，常見的抗菌材料研究仍以無機金屬類化合物為主，如銀、鋅、銅等[4-6].其中，銀價格高昂，且易于氧化變色；銅作為重金屬具有廣泛的細胞毒性作用；而鋅則兼具抗菌譜廣和細胞毒性相對較低的的優(yōu)勢.因此，以鋅為原材料合成抗菌材料受到了生物材料、醫(yī)學等領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[7-10].其中，鋅/黏土礦物復合材料由于具有低成本和綠色環(huán)保等優(yōu)勢，近年來受到廣泛研究[11].研究發(fā)現(xiàn)，黏土礦物的引入可以通過控制鋅基化合物的粒徑和形貌，從而提高復合材料的抗菌性能[12-13].凹凸棒石(attapulgite,APT)是一種層狀含水富鎂鋁的硅酸鹽黏土礦物，理論化學式可表示為(Al2Mg2)Si8O20(OH)2(OH2)4·4H2O[14].其具有獨特的一維納米棒狀結(jié)構(gòu)、永久表面負電荷以及大量規(guī)整孔道結(jié)構(gòu)和表面硅羥基，擁有較大的比表面積、優(yōu)異的吸附性能[15]、表面易修飾等優(yōu)點，因此被廣泛用于各類微納米復合材料的制備[16].層狀雙氧化物(layer double oxides,LDO)是由具有水滑石結(jié)構(gòu)的層狀雙氫氧化物(layer double hydroxides,LDH)高溫煅燒而來.研究表明，在溫度不太高時(一般不超過550 ℃)，LDO化合物與LDH化合物具有相似的結(jié)構(gòu)，將LDO化合物放置于溶液中，此時可重新得到結(jié)構(gòu)完整的LDH[17-18].在LDH化合物中，每個單層是由類水鎂石結(jié)構(gòu)的八面體相互連接組成，在層的形成過程中，八面體中心的二價金屬陽離子可被三價金屬陽離子取代，因而使得單層LDH帶正電荷.為了保持整體結(jié)構(gòu)呈電中性，層間就會相應地填充大量陰離子(如NO3-、CO32-、Cl-)，這些層間陰離子和水分子通過氫鍵和靜電引力與每個LDH單層進行相互作用，從而構(gòu)成完整的LDH化合物[19].此外，由于LDH化合物的主體層板陽離子具有較大的普適性以及層間陰離子較好的離子交換性，使得該化合物可在吸附[20]、催化[21-22]、電極材料[23]、抗菌以及藥物緩釋[24-25]等領(lǐng)域均能發(fā)揮重大潛力.同時，鈷作為鈷胺類輔酶中的活性中心(例如在維生素B12中)，與人體具有較好的生物相容性.因此，本研究擬通過引入鈷元素與鋅元素合成鋅鈷層狀雙氧化物，并將其負載在凹凸棒石上，期望可以合成抗菌性能良好且生物相容性優(yōu)異的抗菌材料.

基于此，為進一步改善鋅基抗菌材料的抗菌活性和生物相容性，降低其生產(chǎn)制作成本.本文以凹凸棒石、氯化鋅和六水合氯化鈷為原料，聯(lián)合共沉淀和煅燒法制備了復合材料凹凸棒石負載的層狀雙氧化物(APT/CoZn LDO).系統(tǒng)地評價了不同凹凸棒石添加量以及不同鋅鈷摩爾比等因素對材料抗菌性能和細胞毒性的影響.同時，對制備的復合材料其結(jié)構(gòu)、理化性能和生物相容性等進行了表征和分析.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凹凸棒石(attapulgite,APT)，產(chǎn)自安徽省明光礦，根據(jù)X-射線熒光光譜測試(XRF)，其主要成分為：Al2O39.69%、MgO 10.94%、SiO251.75%、CaO 1.29%、Na2O 0.48%、K2O 0.99%和Fe2O35.04%.氯化鋅(ZnCl2)、六水合氯化鈷(CoCl2·6H2O)，分析純，購自中國廣東省汕頭市西隴化工有限公司.六亞甲基四胺(HMT)，分析純，購自中國上海市鑫達化工有限公司.水解酪蛋白(MH)瓊脂培養(yǎng)基、L-B肉湯培養(yǎng)基購自中國青島高科園海博生物技術(shù)有限公司.日本同仁CCK-8試劑盒，上海經(jīng)科化學科技有限公司.活/死細菌活力試劑盒(L 7012)，美國Invitrogen公司.標準菌株金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)，大腸埃希菌(ATCC 25922)，來自蘭州大學第二醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心.Hela細胞株，中國科學院近代物理研究所購自江蘇省江陰齊式生物科技有限公司.所有化學試劑均未進行進一步純化，如無特殊說明，所有溶液均使用去離子水配制.

1.2 樣品的制備

將8 mmol ZnCl2和1 mmol CoCl2·6H2O溶解于100 mL去離子水中，并將稱量好的40 wt.% APT加入上述溶液中并攪拌均勻.得到的溶液在超聲細胞破碎儀中超聲30 min后，在100 ℃油浴下劇烈攪拌，逐滴滴加含48 mmol的HMT溶液并繼續(xù)攪拌反應12 h.待反應結(jié)束后，將沉淀物進行多次離心洗滌至pH中性，并于60 ℃烘箱中干燥.得到的固體產(chǎn)物經(jīng)研磨粉碎、過200目篩，備用.將上述合成的化合物在馬弗爐中分別經(jīng)300、400、500、600、700和800 ℃煅燒4 h后，經(jīng)研磨過篩得到系列產(chǎn)物.為了考察煅燒溫度對復合材料抗菌性能的影響，將上述系列產(chǎn)物分別進行抗菌性能測試，根據(jù)抗菌性能的優(yōu)劣判斷最佳煅燒溫度.同理，考察系列不同鋅鈷摩爾比例和凹凸棒石添加量樣品的抗菌性能，找到最優(yōu)凹凸棒石添加量和鋅鈷摩爾比.同時，將不添加CoCl2·6H2O制備的產(chǎn)物APT/ZnO標記為對照組.具體的樣本制備條件見表1.

表1 樣本的制備條件和編號

1.3 樣品表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM,JSM-6701F型JEOL,日本)，用于觀察樣品的形貌，測試前樣品經(jīng)噴金處理；透射電子顯微鏡(TEM,F-30型 Tecnai，荷蘭)，測試前將樣品分散于無水乙醇中，滴在碳膜銅網(wǎng)上晾干；傅里葉紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR)：Nicolet NEXUS型(Thermo,美國)，在掃描波長4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)分析樣品組成，樣品經(jīng)KBr壓片法制備；多晶X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)：X′Pert型(PANnalytical，荷蘭)，測試條件：連續(xù)記譜掃描，Cu-Kα 輻射，狹縫寬度0.5°，掃描速度0.05°/s，電壓40 kV，電流強度30 mA，掃描范圍2θ=3°～80°；X-射線熒光光譜儀(X Ray Fluorescence,XRF)：由MiniPal 4臺式能量色散(Panalytical 荷蘭)獲得.

1.4 體外抗菌試驗

采用瓊脂稀釋法評價抗菌材料的抗菌性能[26]，通過最低抑菌濃度值(MIC)評價樣品的抗菌活性，MIC為抗菌材料抑制細菌生長的最低濃度.以水解酪蛋白(MH)瓊脂為培養(yǎng)基，分別對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸埃希菌)兩種細菌進行測試.取-80 ℃保存的標準菌種金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)和大腸埃希菌(ATCC 25922)，將其接種至L-B肉湯中進行復活，當細菌傳代進入對數(shù)期時，制備標準菌株菌懸液.調(diào)整菌懸液至0.5 McFarland標準濁度，含菌量約1×108CFU/mL，再稀釋濃度至1×107CFU/mL后備用.然后，制備濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/mL的含抗菌材料的瓊脂平板.最后，用加樣槍吸取1 μL上述菌懸液(含菌量約為1×104CFU/μL)，點種于含抗菌材料的平皿內(nèi).每個平皿分別點種在3個不同的位置，并進行2次重復試驗.將所有平板移至二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，觀察細菌生長情況.同時設(shè)置陽性對照組，為不含抗菌材料，但接種細菌的MH瓊脂培養(yǎng)基；陰性對照組，不含抗菌材料且未接種細菌的MH瓊脂培養(yǎng)基.

1.5 細菌活力試驗

采用活/死細菌活力試劑盒來測定金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌在APT/ZnCo LDO-1中的細菌活性.將金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌用0.9% NaCl配制成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，并與APT/ZnCo LDO-1在37 ℃下共培養(yǎng)12 h.然后，以10 000 r/min離心10 min后棄上清并重懸沉淀，在室溫黑暗的環(huán)境中熒光染色15 min.采用倒置熒光顯微鏡(EVOS,Thermo,USA)對細菌的熒光染色結(jié)果進行成像和觀察.膜受損的死細菌被PI染液染成紅色熒光，而膜完好無損的活細菌被SYTO 9染成綠色熒光[27].

1.6 生物相容性試驗

1.6.1 細胞培養(yǎng) Hela細胞的培養(yǎng)條件，DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基中含10%胎牛血清、100單位/mL的青霉素和鏈霉素，在含5% CO2的37 ℃溫箱中培養(yǎng).

1.6.2 細胞相對增值率試驗 采用CCK-8法測試復合材料的細胞生物相容性.CCK-8法是細胞增殖或毒性試驗中測定活細胞數(shù)量的一種高靈敏度、非放射性比色法試驗.活細胞內(nèi)的脫氫酶還原WST-8并產(chǎn)生可溶解于培養(yǎng)基的橙黃色產(chǎn)物福爾馬臜染料，細胞中脫氫酶生成的福爾馬臜染料的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比[28].將100 μL的Hela細胞懸液接種于96孔板中的每個孔中，細胞密度為1(104細胞/孔，37 ℃孵育24 h.待細胞貼壁后分別加入100 μL含有不同濃度(0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL)復合材料的新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)孵育24、48、72 h.并在加入抗菌材料后的第24、48、72 h 時，向每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，顯色孵育3 h后，測定其吸光度值(λ=450 nm).試驗對照組為不添加抗菌材料的Hela細胞.每個樣品的細胞增值率是3次重復試驗的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 體外性能試驗

表2為制得的系列復合材料APT/ZnCo LDO對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌結(jié)果.從表2中可以發(fā)現(xiàn)，材料在經(jīng)過300 ℃和400 ℃煅燒后，其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC分別為0.25 mg/mL和1.0 mg/mL.然而，在經(jīng)500 ℃煅燒后，其抗菌性能有了明顯提高，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值分別達到0.125 mg/mL和0.5 mg/mL.之后，隨著煅燒溫度的進一步提高，復合物的抗菌效果反而下降.當煅燒溫度達到800 ℃時，其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC分別降為>1.0 mg/mL和>2.0 mg/mL.上述結(jié)果表明制備抗菌材料的最佳煅燒溫度為500 ℃.

隨后，考察APT添加量為40 wt.%，煅燒溫度為500 ℃的條件下，不同鋅鈷摩爾比的系列樣品的抗菌性能.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鋅鈷摩爾比為8∶1的產(chǎn)物APT/ZnCo LDO-1與不添加Co的對照樣品APT/ZnO擁有相同且最佳的抗菌效果，其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC分別為0.125 mg/mL和0.5 mg/mL.

最后，評價鋅鈷摩爾比為8∶1，煅燒溫度為500 ℃，不同凹凸棒石添加量的系列樣品的抗菌性能.從表2的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著APT的添加量從0增加到40 wt.%，復合材料對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌效果并無改變.但是，凹凸棒石的添加量增加，會明顯減少復合材料鋅鈷的相對添加量，這表明引入凹凸棒石提高了鋅鈷雙氧化物的抗菌活性.

表2 樣品對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC

2.2 材料表征

2.2.1 形貌分析 所制備的復合材料煅燒前后的形貌如圖1和圖2所示.從圖1-A和1-B中可以發(fā)現(xiàn)，復合材料是由一維棒狀結(jié)構(gòu)APT和二維層狀的LDO所組成的化合物.圖1-C為復合材料煅燒前的形貌，是由一維棒狀結(jié)構(gòu)的APT和二維六邊形的LDH結(jié)構(gòu)組成.對比煅燒前后材料的表面微觀形貌，發(fā)現(xiàn)LDH表面相對光滑的片狀結(jié)構(gòu)在經(jīng)500 ℃煅燒后變得粗糙，并有部分區(qū)域出現(xiàn)顆粒團聚現(xiàn)象.這歸咎于煅燒使得LDH主體層板上的結(jié)構(gòu)羥基以及層間陰離子、層間水的脫除[18].

A、B：APT/ZnCo LDO-1；C：APT/ZnCo LDH.A and B：APT/ZnCo LDO-1；C：APT/ZnCo LDH.圖1 樣品煅燒前后的SEMFigure 1 SEM images of APT/ZnCo LDO-1

圖2-A是抗菌材料APT/ZnCo LDO-1在透射電子顯微鏡下的微觀形貌，圖2-B是其煅燒前的形貌結(jié)構(gòu).從圖2-A中清晰地發(fā)現(xiàn)材料是由一維棒狀APT與二維層狀LDO組成的混維結(jié)構(gòu)，并且它們之間接觸緊密，可能存在一定的物理或化學作用.與SEM結(jié)果一致，觀察到六邊形的LDO結(jié)構(gòu)，與煅燒前的結(jié)構(gòu)相比，復合物在煅燒后出現(xiàn)顆粒團聚的現(xiàn)象.圖2-C～F展示了細菌與抗菌材料APT/ZnCo LDO-1接觸前后的形貌變化.其中，圖2-C和2-E分別為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的形貌圖，觀察到金黃色葡萄球菌呈圓球狀，大腸埃希菌呈長桿狀，菌體表面光滑、邊緣整齊且細胞結(jié)構(gòu)完整.圖2-D和2-F分別展示金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌與抗菌材料接觸12 h后的形貌變化.圖2-D中3個金黃色葡萄球菌被抗菌材料成功“捕獲”，且菌體形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則狀，邊緣不再完整，細菌結(jié)構(gòu)遭到破壞.圖2-F中同樣發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌菌體表面變得粗糙，形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞呈不規(guī)則狀.

A：APT/ZnCo LDO-1；B：APT/ZnCo LDH；C、E：分別為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌；D：金黃色葡萄球菌與APT/ZnCo LDO-1接觸12 h后；F：大腸埃希菌與APT/ZnCo LDO-1接觸12 h后.A：APT/ZnCo LDO-1；B：APT/ZnCo LDH；C and E：S.aureus and E.coli,respectively；D and F：The bacteria of S.aureus and E.coli exposure to APT/ZnCo LDO-1 for 12 h,respectively.圖2 APT/ZnCo LDO-1和細菌的透射電子顯微鏡圖片F(xiàn)igure 2 TEM images of APT/ZnCo LDO-1 and the bacteria

2.2.2 FTIR分析 圖3-A為不同煅燒溫度下的系列材料APT/ZnCo LDO的傅里葉變換紅外光譜圖.如圖所示，在437 cm-1附近處出現(xiàn)的吸收帶，隨著煅燒溫度的升高，逐漸變窄，并伴有位移和振動強度的降低，吸收帶位于428、438、439、448、464 cm-1處，分別歸屬于Zn-O和Co-O鍵的振動[29-30].在3 442和3 550 cm-1處的振動帶分別與Si-OH和Mg-OH中的羥基拉伸振動有關(guān)[31].隨著煅燒溫度的增加，3 550 cm-1處的羥基振動帶強度降低，直到800 ℃時完全消失，并形成以3 450 cm-1為中心的寬帶.這些峰位置的遷移，主要歸因于APT的結(jié)構(gòu)變化，包括沸石水和結(jié)構(gòu)水的損失、晶體結(jié)構(gòu)的坍塌和晶相相變.1 655 cm-1處的頻帶是由吸附在APT和LDO上的水分子彎曲振動造成，從圖中觀察到，隨著煅燒溫度的增加，振動帶的強度減弱.984、1 031 cm-1處出現(xiàn)的特征吸收帶，可能與APT框架中的Si-O-Si鍵或?qū)觾?nèi)Si-O-Si鍵的的彎曲振動有關(guān)[32].此外，1 031 cm-1處的譜帶在隨著煅燒溫度增加到700 ℃時，右移到了950 cm-1處，與煅燒溫度600 ℃相比，峰的強度明顯增加，然后隨著煅燒溫度的進一步升高而升高，這說明在高溫煅燒下，APT骨架結(jié)構(gòu)中Si-O-Si或Mg(Si)-OH基團振動強度發(fā)生了改變.

圖3 不同煅燒溫度下的APT/ZnCo LDO的紅外光譜圖(A)和XRD譜圖(B)Figure 3 FTIR spectra (A) and XRD patterns (B) of APT/ZnCo LDO at different calcination temperatures

2.2.3 XRD分析 為了更好地研究樣品的結(jié)構(gòu)變化，圖3b展示了不同煅燒溫度下的APT/ZnCo LDO的XRD結(jié)果.在復合材料APT/ZnCo LDO的XRD譜圖中，位于2θ=8.5°、19.8°、25.5°和28.1°處出現(xiàn)了APT的特征衍射峰，分別歸屬于(110)、(040)、(231)和(400)晶面(PDF# No.29-0855)[33].且隨著煅燒溫度的升高，這些衍射峰的強度顯著降低或者消失.在300 ℃煅燒時，尚未觀察到明顯變化，但當煅燒溫度升高到400 ℃時，2θ=28.1°處的衍射峰強度變?nèi)?，且隨著溫度的繼續(xù)升高最終消失.當煅燒溫度達到600 ℃時，2θ=8.49°處出現(xiàn)的衍射峰消失.材料經(jīng)700 ℃煅燒后，位于2θ=19.8°處的衍射峰也隨之消失.以上結(jié)果表明APT框架內(nèi)的Si-O或Si-O-Si基團在煅燒過程中發(fā)生了變化.此外，在APT/ZnCo LDO-800上觀察到2θ=39.4°處出現(xiàn)的弱衍射峰，這表明在一定程度上，由于APT結(jié)構(gòu)內(nèi)失去鎂羥基，導致APT堿度降低，可能會產(chǎn)生石英相的SiO2[34].此外，在2θ=31.8°、34.4°、36.3°、47.5°、56.6°、62.9°、68.0°和69.1°處出現(xiàn)的衍射峰可歸屬于六方ZnO纖鋅礦結(jié)構(gòu)(PDF# No.36-1451)，其對應的晶面分別為(100)、(020)、(101)、(110)、(103)、(112)和(201)[34].從圖中發(fā)現(xiàn)，APT/ZnCo LDO復合材料的XRD譜圖中均發(fā)現(xiàn)了ZnO的特征衍射峰，但其衍射峰的強度和位置略有不同.隨著煅燒溫度的升高，衍射峰逐漸變得更加尖銳，同時峰的強度也增大，表明復合物的結(jié)晶度得到了一定提升.在2θ=38.5°、44.8°、55.7°和59.4°出現(xiàn)的衍射峰分別對應于CoO (222)、(400)、(422)和(511)的晶面(PDF# No.42-1467)[30].與ZnO的衍射峰相似，CoO的衍射峰也會隨著溫度的升高而強度增加.總體來說，隨著煅燒溫度的升高，復合物的XRD衍射峰將逐漸銳化，這可歸咎于晶粒的尺寸增大或晶格應變的減小[35].

2.3 細菌活力試驗

圖4為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌與APT/ZnCo LDO-1接觸前后的細菌活力變化圖.圖4-A和4-D分別為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌與抗菌材料APT/ZnCo LDO-1接觸前的熒光染色照片.發(fā)現(xiàn)其均被熒光染液SYTO 9染為綠色熒光，說明細菌菌體結(jié)構(gòu)完好，細胞活力良好.細菌和抗菌材料接觸12 h后，可以發(fā)現(xiàn)細菌菌體均被染為紅色熒光(圖4-B和4-E)，說明細菌菌體結(jié)構(gòu)遭到破壞，細胞壁不再完整，紅色熒光染液PI進入細菌內(nèi)部.值得一提的是，圖4-C和4-F展現(xiàn)細菌和抗菌材料接觸12 h后，在熒光顯微鏡下的復合圖片，發(fā)現(xiàn)被染為紅色熒光的死細菌主要黏附在抗菌材料表面.

2.4 生物相容性試驗

通過CCK-8試驗評價凹凸棒石和鈷的添加量抗菌材料的生物相容性的影響.在CCK-8試驗中，如果材料和細胞經(jīng)過一定時間的共培養(yǎng)后，若細胞相對增殖率仍大于或等于75%，則該復合材料被認為無細胞毒性作用.圖5-A～C和圖5-D～F分別為不同鋅鈷摩爾比例和不同凹凸棒石添加量APT/ZnCo LDH分別在在0.5、0.25、0.125和0.062 5 mg/mL的濃度下與Hela細胞共同孵育24、48、72 h后的細胞相對增值率.由圖5-A發(fā)現(xiàn)，所有材料在經(jīng)過24 h的孵育后，細胞相對增值率均大于75%，說明此時材料均未表現(xiàn)出細胞毒性.但當APT/ZnO與Hela細胞共孵育48 h后(圖5-B)，在0.5 mg/mL濃度下，其細胞相對增值率<75%；且當孵育時間延長到72 h時 (圖5-C)，APT/ZnO在濃度為0.5和0.25 mg/mL時，細胞相對增值率均<75%，表明其細胞毒性隨時間延長而增強.然而，APT/ZnCo LDO-1、APT/ZnCo LDO-2、APT/ZnCo LDO-3、APT/ZnCo LDO-4在不同濃度下，經(jīng)過24、48、72 h孵育后，其細胞相對增值率均>75%.與未添加Co的對照組APT/ZnO相比，抗菌材料在引入Co后其細胞毒性作用減弱；同時，隨著材料中鈷添加量的增加，細胞的相對增值率不斷提高，說明Co的引入減少材料中鋅的添加量，從而降低了細胞毒性.從圖5d,e和f中，觀察到抗菌材料在添加不同比例的凹凸棒石后，其生物相容性發(fā)生了變化.圖5-A中當凹凸棒石添加量為0和10 wt.%時，在0.5 mg/mL和0.25 mg/mL的濃度下表現(xiàn)出細胞毒性；當凹凸棒石添加量≥20 wt.%時，其細胞毒性作用減弱，細胞相對增值率均>75%，并且隨著與細胞共同孵育時間的延長(圖5-B～C)，依然表現(xiàn)出良好的生物相容性.

A、D：金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌；B：為金黃色葡萄球菌與APT/ZnCo LDO-1培養(yǎng)12 h后；E：為大腸埃希菌與APT/ZnCo LDO培養(yǎng)12 h后；C：為金黃色葡萄球菌與APT/ZnCo LDO-1培養(yǎng)12 h后APT/ZnCo LDO-1和細菌的復合圖；F：大腸埃希菌與APT/ZnCo LDO-1培養(yǎng)12 h后APT/ZnCo LDO和細菌的復合圖.A and D：The images of S.aureus and E.coli；B and E：The images of S.aureus and E.coli after cultured with APT/ZnCo LDO-1 for 12 h，respectively；C and F：The images of S.aureus and E.coli with APT/ZnCo LDO-1,after incubation for 12 h.圖4 細菌與APT/ZnCo LDO-1接觸前后的細菌活力熒光染色結(jié)果Figure 4 LIVE/DEAD bacterial viability assay of S.aureus and E.coli

3 討論

復合材料的抗菌性能試驗結(jié)果表明，鋅鈷摩爾比為8∶1，經(jīng)過500 ℃煅燒后的抗菌材料APT/ZnCo LDO-1與不添加Co的對照組APT/ZnO表現(xiàn)出相同的抗菌性能；這說明復合材料中發(fā)揮抗菌作用的主要成分是鋅，而將鈷引入復合材料后，減少了材料中鋅源的使用量，但材料依然展現(xiàn)出良好的抗菌性能.同時，APT的添加量為40 wt.%的抗菌材料APT/ZnCo LDO-1與不添加APT的對照組ZnCo LDO相比，表現(xiàn)出相同的抗菌活性；而隨著抗菌材料中APT添加量的增加，相同濃度下的抗菌材料中鋅鈷的質(zhì)量卻顯著降低，但材料依然維持良好的抗菌性能.這表明在抗菌材料中引入價廉的天然粘土礦物APT后，在提高鋅鈷雙氧化物抗菌活性的同時，還大大降低了抗菌材料的生產(chǎn)成本.抗菌材料在引入鈷和凹凸棒石后，抗菌性能的改善可能歸因于試驗中鈷和鋅合成的雙氧化物LDO結(jié)構(gòu)和APT具有良好的物理和化學吸附能力，能提高抗菌材料對細菌的吸附網(wǎng)羅能力，將細菌牢固吸附在抗菌材料表面；此外，APT具有較大的比表面積，能有效提高鋅鈷雙氧化物的分散性能，并減少金屬氧化物團聚現(xiàn)象的發(fā)生.綜上，在引入鈷和凹凸棒石后，抗菌材料的抗菌性能得了顯著改善.復合材料的最佳制備條件為鋅鈷摩爾比為8∶1，凹凸棒石添加量為40 wt.%，煅燒溫度為500 ℃，即APT/ZnCo LDO-1.其對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值分別為0.125 mg/mL和0.5 mg/mL.

通過分析抗菌材料的抗菌性能，發(fā)現(xiàn)樣品在經(jīng)過300～800 ℃煅燒的過程中，擁有最佳抗菌性能的煅燒溫度為500 ℃.對系列材料進行FTIR和XRD分析，抗菌材料在經(jīng)過高溫煅燒后，出現(xiàn)化合物ZnO和CoO的衍射峰，且衍射強度隨著煅燒溫度的升高而增強.這說明鋅鈷層狀雙氫氧化物經(jīng)過高溫煅燒后變?yōu)殇\鈷層狀雙氧化物，而將層狀雙氧化物結(jié)構(gòu)置于溶液后，會恢復為原來的層狀結(jié)構(gòu).這一過程需要在給定范圍內(nèi)才能進行重構(gòu)，焙燒溫度必需足夠高，以消除層狀雙氫氧化物中間層的大多數(shù)陰離子；但是，如果煅燒溫度過高，高于550 ℃時，層狀雙氧化物結(jié)構(gòu)則無法重建[17].所以，材料在經(jīng)過600 ℃及以上的高溫煅燒后，會出現(xiàn)LDO結(jié)構(gòu)的塌陷，在溶液中無法恢復片層狀結(jié)構(gòu)，影響其在抗菌過程中對細菌的吸附作用，從而降低材料的抗菌性能.此外，XRD結(jié)果顯示，當煅燒溫度達到600 ℃及以上時，材料中APT的特征衍射峰變?nèi)鹾拖КF(xiàn)象；同樣地，F(xiàn)TIR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于3 550和1 655 cm-1的振動帶出現(xiàn)位移及強度減弱現(xiàn)象.這些現(xiàn)象說明抗菌材料中的APT發(fā)生了晶體結(jié)構(gòu)和孔洞結(jié)構(gòu)的塌陷[31]，造成APT結(jié)構(gòu)破壞和比表面積降低，導致APT對細菌的吸附性能降低，并影響鋅鈷雙氧化的分散性和穩(wěn)定性，降低材料的抗菌活性.

A～C：分別為APT/ZnCo LDO-1、APT/ZnCo LDO-2、APT/ZnCo LDO-3、APT/ZnCo LDO-4和APT/ZnO與Hela細胞共同孵育24 h、48 h和72 h后的細胞相對增值率；D～F：分別為ZnCo LDO、APT/ZnCo LDO-5、APT/ZnCo LDO-6、APT/ZnCo LDO-1和APT/ ZnCo LDO-7與Hela細胞共同孵育24 h、48 h和72 h后的細胞相對增值率.Various concentrations of APT/ZnCo LDO and APT/ZnO with different molar ratios of Zn/Co.A～C and ZnCo LDO with different contents of APT (D～F) after incubation for 24,48,and 72 h,respectively.The data are provided the mean standard deviation of three parallel experiments.圖5 樣品的細胞相對增值率Figure 5 Cell viability (CCK-8 assay) of Hela cells

通過對細菌和抗菌材料APT/ZnCo LDO-1接觸前后的形貌變化進行分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)細菌在與抗菌材料接觸后，細菌菌體的形貌由規(guī)則、光滑、完整變?yōu)椴灰?guī)則、粗糙和破碎的狀態(tài)；死亡的細菌大量黏附在抗菌材料表面(圖2-D和圖2-F).同樣地，在細菌活力試驗的結(jié)果中，同樣發(fā)現(xiàn)被染為紅色熒光的死細菌大量黏附在抗菌材料表面.死細菌大量附著在抗菌材料表面，可能與凹凸棒石擁有的物理和化學吸附性能、自身攜帶負電荷和表面大量的Si-OH基團有關(guān)，其與細菌細胞壁表面的正電荷和有機物結(jié)合形成化學鍵，從而使得細菌被固定在材料表面.細菌在被固定在材料表面后，會增大抗菌材料與細菌的有效接觸面積，提高抗菌活性物質(zhì)鋅和鈷的釋放；同時破壞細菌的細胞膜屏障，消耗表面離子梯度濃度，最終引起細菌腫脹，細胞壁結(jié)構(gòu)破壞，引起細胞質(zhì)外泄，導致細菌死亡[36].鋅鈷雙氧化物LDO的抗菌機理可能與材料生成活性氧(ROS)[37]；金屬氧化物粒子穿過細菌細胞壁，滲入到細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)進行重新聚合，產(chǎn)生抗菌作用有關(guān)[38].如圖2-A所示，本試驗制備的鋅鈷層狀雙氧化物的平均尺寸均大于200 nm.這表明抗菌材料APT/ZnCo LDO-1不太可能直接穿透細菌的細胞壁，進入細菌內(nèi)部，從而引起細菌死亡.但是，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌在和抗菌材料接觸后，確實發(fā)生了菌體的變形，細菌結(jié)構(gòu)遭到破壞等形態(tài)學的改變.這說明APT/ZnCo LDO在發(fā)揮抗菌作用時，可能是氧化鋅和氧化鈷生成ROS發(fā)揮的作用.然而，有關(guān)ROS的生成及其抗菌作用過程仍需更進一步的研究來闡明.

系列抗菌材料的生物相容性結(jié)果表明，隨著抗菌材料中鈷和凹凸棒石添加量的不斷增加，抗菌材料的細胞毒性呈下降趨勢.說明鈷和凹凸棒石的引入，改善了材料的生物相容性.這可能與鈷和凹凸棒石的引入，降低了鋅的相對添加量；凹凸棒石為綠色、無毒的天然納米材料，具有良好的生物相容性有關(guān).

4 結(jié)論

本研究聯(lián)合共沉淀與煅燒法成功制備了一種混維抗菌復合材料APT/ZnCo LDO.研究表明，經(jīng)過500 ℃煅燒、引入40 wt.% APT和12.5 wt.% Co(鋅鈷摩爾比為8∶1)之后，制備的復合材料具有優(yōu)異的抗菌性能和細胞生物相容性，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值分別達到0.125 mg/mL和0.5 mg/mL.凹凸棒石和鈷的引入減少了抗菌活性組分中鋅的相對添加量，這不僅降低了抗菌材料的生產(chǎn)制備成本，還顯著提升了材料的生物相容性，可作為提高鋅基抗菌材料抗菌性能和生物相容性的有效策略.