劉真，朱麗霞

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300）

5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛是含氧的呋喃類化合物，作為重要的風(fēng)味化合物，具有持久的焦糖[1]和水果香味，可使香氣豐滿、柔和、清潤(rùn)、協(xié)調(diào)、綿長(zhǎng)，廣泛存在于食品，姚萬欣等[2]研究表明尤其在熱加工類食物體系中。馮云超等研究結(jié)果表明[3]5-羥甲基糠醛和糠醛是啤酒熱負(fù)荷指示劑及老化指示劑。Huber[4]研究表明呋喃酮具有較低的閾值，微量的添加就有明顯的增香修飾效果，且香味持久，劉曉鳳等[5]研究表明可用于調(diào)配菠蘿、草莓、牛肉等食用香精。凌廣軒等[6]研究表明乙酰呋喃廣泛應(yīng)用于食品添加劑。

自然存在的5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛的含量低，常規(guī)理化方法難以檢測(cè)，多以氣相色譜－質(zhì)譜法[7]、氣相色譜嗅覺測(cè)量法和氣相色譜儀。然而在氣相色譜－質(zhì)譜法、氣相色譜嗅覺測(cè)量法和氣相色譜儀測(cè)呋喃物質(zhì)時(shí)，因其樣品處理方式不同，可分為液液萃取－氣相色譜－質(zhì)譜法[8]和頂空固相微萃?。瓪庀嗌V－質(zhì)譜法[9]。如果采用液液萃?。瓪庀嗌V－質(zhì)譜法，進(jìn)樣口溫度過高，會(huì)使樣品發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生呋喃類物質(zhì)，導(dǎo)致結(jié)果偏高；采取頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法時(shí)，樣品要經(jīng)過吸附、脫附等過多環(huán)節(jié)，進(jìn)樣量偏少，且頂空進(jìn)樣需要控制氣液平衡，容易受環(huán)境波動(dòng)，無法保證靈敏度和穩(wěn)定性[10]。多項(xiàng)研究表明[11-13]5-羥甲基糠醛、呋喃酮和糠醛也可以用高效液相檢測(cè)，其突出優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)便易操作，靈敏度好，分析速度快，樣品處理簡(jiǎn)單，選擇性高。但目前沒有將5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛一次性檢出的高相液相檢測(cè)的相關(guān)方法報(bào)道。由此，本試驗(yàn)擬用高效液相色譜法建立多呋喃物質(zhì)（5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛）的檢測(cè)方法，以提供方便、快捷、簡(jiǎn)單的呋喃類共檢出方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

5-羥甲基糠醛（色譜純）、糠醛（色譜純）、呋喃酮（色譜純）、乙酰呋喃（色譜純）、5-甲基糠醛（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

島津高效液相色譜儀：島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；Ultimate XB-C18 柱：月旭科技（上海）股份有限公司；Universal32R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用分析天秤分別準(zhǔn)確稱取5-羥甲基糠醛100 mg、糠醛62.4 mg、呋喃酮480 mg、乙酰呋喃64 mg、5-甲基糠醛161.3 mg 放入1 000 mL 容量瓶中，用甲醇（色譜純）定容成質(zhì)量濃度分別為 100、62.4、480、64、161.3 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以備用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為第一濃度梯度，以5 倍的濃度梯度，依次稀釋。配制混標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度如表1，以進(jìn)樣量 10 μL 測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別以5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛的質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程?；鞓?biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度見表1。

表1 混標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度Table 1 Mixed standard solution concentration gradient mg/L

1.3.3 高效液相檢測(cè)5 種呋喃物質(zhì)的方法

色譜柱為Ultimate XB-C 18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為 35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，285 nm 波長(zhǎng)，流速0.8 mL/min。以呋喃酮文獻(xiàn)檢測(cè)梯度洗脫條件為參照[13]，見表2。

表2 5 個(gè)混標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)梯度洗脫條件Table 2 Detection gradient elution conditions for five mixed standards

1.3.4 5 種呋喃物質(zhì)回收率及精密度試驗(yàn)

吸取5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛備用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋。5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度為100、4、0.16 mg/L；糠醛質(zhì)量濃度為62.4、2.49、0.099 6 mg/L；呋喃酮質(zhì)量濃度為 480、19.2、0.768 mg/L；乙酰呋喃質(zhì)量濃度為 64、2.6、0.104 mg/L；5-甲基糠醛質(zhì)量濃度為161.3、6.5、0.26 mg/L。按表2高效液相色譜條件測(cè)定，質(zhì)量濃度每批重復(fù)測(cè)定5 次，總共3 批，計(jì)算回收率。

1.3.5 5 種呋喃物質(zhì)最低檢測(cè)線、定量線的測(cè)定

3 倍和10 倍噪音值法是色譜儀器中估算檢出限和定量限[14]常用的方法，即測(cè)量等同于空白溶液測(cè)量信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差3 倍和10 倍的樣品濃度或含量為檢出限和定量限。將5 種呋喃標(biāo)品的最低濃度設(shè)10 次重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別以3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法得到檢出限和定量限。

1.3.6 5 種呋喃物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取上述5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛備用混標(biāo)準(zhǔn)液，按表2 色譜條件于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

按因素分析法對(duì)高效液相方法的回收率、精密度、最低檢測(cè)線、定量線、穩(wěn)定性等幾種因素進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相檢測(cè)5種呋喃物質(zhì)方法

在高效液相色譜檢測(cè)的脫洗梯度條件下0～2 min，甲醇-0.5%甲酸（15∶85，體積比）；2 min～24 min，甲醇-0.5%甲酸（50∶50，體積比）；24 min～27 min，甲醇-0.5%甲酸（100∶0，體積比）；27 min～29 min，甲醇-0.5 %甲酸（100∶0，體積比）；29 min～33 min，甲醇-0.5 %甲酸（15∶85，體積比）。5 種呋喃物質(zhì)的檢測(cè)出峰見圖1。

圖1 5 種呋喃物質(zhì)色譜圖Fig.1 Five kinds of furan substance chromatogram

如圖 1 所示，8.75 min 為 5-羥甲基糠醛；11.56 min為糠醛；14.45 min 為呋喃酮；17.39 min 為乙酰呋喃；19.31 min 為5-甲基糠醛，5 個(gè)呋喃物質(zhì)的分離度和峰型都很好。

2.2 5種呋喃物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

5 種呋喃物質(zhì)的混標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表3。

表3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和濃度線性范圍Table 3 Regression equation，correlation coefficient and concentration linear range

5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛的峰面積與對(duì)應(yīng)濃度相關(guān)性均在0.999 以上，5-羥甲基糠醛線性關(guān)系在0.160 mg/L～100 mg/L；糠醛線性關(guān)系在0.099 6 mg/L～62.4 mg/L；呋喃酮線性關(guān)系在0.768 mg/L～480 mg/L；乙酰呋喃線性關(guān)系在0.104 mg/L～64 mg/L；5-甲基糠醛線性關(guān)系在0.260 mg/L～161.3mg/L。

2.3 各組分最低檢測(cè)線、定量線的測(cè)定

檢測(cè)5 種呋喃物質(zhì)最低濃度結(jié)果見表4。

將5 種呋喃標(biāo)品的最低濃度設(shè)10 次重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別以3 倍和10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為方法得到檢出限和定量限。結(jié)果表明：5-羥甲基糠醛檢出限0.153 mg/L、定量限0.154 mg/L；糠醛檢出限0.086 mg/L、定量限0.09 mg/L；呋喃酮檢出限0.712 mg/L、定量限0.714 mg/L；乙酰呋喃檢出限0.094 mg/L、定量限0.091 mg/L；5-甲基糠醛檢出限0.240 mg/L、定量限0.250 mg/L。

表4 檢測(cè)5 種呋喃物質(zhì)最低濃度結(jié)果Table 4 The results of detecting the lowest concentration of five furan substances are shown mg/L

2.4 5種有效成分的回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The recovery test results are shown

由表5 可見，5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛的回收率分別為97.8 %～99.6 %、95.4%～97.3%、96.3%～97.2%、95.3%～98.3%、94.3%～97.9%。說明該方法準(zhǔn)確度高。批內(nèi)變異系數(shù)均小于3%，批間變異系數(shù)均小于5%，符合檢測(cè)要求[15]。

2.5 高效液相檢測(cè)5種呋喃物質(zhì)變異系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

5 種呋喃物質(zhì)變異系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 5 種呋喃物質(zhì)變異系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The test results of the five furan matter coefficient of variation are shown mg/L

由表6 可以看出，備用混標(biāo)準(zhǔn)品溶液5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛在12 h 內(nèi)的變異系數(shù)分別為3.3 %、4.3 %、0.89 %、5.3 %、1.4 %，5種呋喃物質(zhì)變異程度小于15%。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析見表7。

表7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 7 Statistical analysis of the data is shown

表7 包括該方法對(duì)5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛檢測(cè)方法的回收率、精密度、檢出限、定量限、穩(wěn)定性。通過數(shù)據(jù)得知，此方法適合檢測(cè)5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛。

3 結(jié)論與討論

在參照文獻(xiàn)[13]高效液相色譜方法條件的基礎(chǔ)上，建立一種多呋喃物質(zhì)（5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛）的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，5-羥甲基糠醛線性關(guān)系在0.160 mg/L～100 mg/L 良好，檢出限0.153 mg/L、定量限0.154 mg/L，平均回收率為98.6%；糠醛線性關(guān)系在0.099 6 mg/L～62.4 mg/L 良好，檢出限0.086 mg/L、定量限0.09 mg/L，平均回收率為96.5 %；呋喃酮線性關(guān)系在0.768 mg/L～480 mg/L 良好，呋喃酮檢出限0.712 mg/L、定量限0.714 mg/L，平均回收率為96.8 %；乙酰呋喃線性關(guān)系在0.104 mg/L～64 mg/L 良好，檢出限0.094 mg/L、定量限0.091 mg/L，平均回收率為96.7 %；5-甲基糠醛線性關(guān)系在0.260 mg/L～161.3 mg/L 良好，檢出限 0.240 mg/L、定量限 0.250 mg/L，平均回收率為95.8%。且批內(nèi)變異系數(shù)均小于3%，批間變異系數(shù)均小于5%，適合檢測(cè)樣品中5-羥甲基糠醛、糠醛、呋喃酮、乙酰呋喃、5-甲基糠醛5 種呋喃物質(zhì)含量。

與頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法[16]相比，避免了高溫、進(jìn)樣量對(duì)結(jié)果的影響，氣相色譜-質(zhì)譜法操作環(huán)節(jié)繁多、復(fù)雜，需要控制氣液平衡，容易受環(huán)境波動(dòng)。本試驗(yàn)方法樣品前處理簡(jiǎn)單，靈敏度好，簡(jiǎn)單易操作，大大縮短檢測(cè)時(shí)間。根據(jù)目前高效液相檢測(cè)呋喃類物質(zhì)[11，17-18]的相關(guān)報(bào)道，還沒有一次性檢測(cè)多種呋喃物質(zhì)的方法。本試驗(yàn)檢測(cè)呋喃類物質(zhì)不管在精密度、穩(wěn)定性、回收率、檢測(cè)量方面占有很大的優(yōu)勢(shì)。利用高效液相建立多呋喃物質(zhì)檢測(cè)方法時(shí)，不但檢測(cè)出5-羥甲基糠醛、糠醛、乙酰呋喃、呋喃酮、5-甲基糠醛5 種呋喃類物質(zhì)，與此同時(shí)檢測(cè)了苯乙酸乙酯香氣物質(zhì)，且有出峰效果。