吳怡亮，仲 磊，馬 寧，裴 斐，馬高興，胡秋輝,*

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

免疫調(diào)節(jié)與各種生理和病理狀況密切相關(guān)，如炎癥、癌癥和腫瘤的發(fā)生等[1]。作為人體內(nèi)的一種重要防御，巨噬細(xì)胞釋放的免疫介質(zhì)在抗原入侵時(shí)發(fā)揮重要作用[2]。當(dāng)人體受到病理或機(jī)械損傷刺激時(shí)，激活的巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，可以產(chǎn)生一氧化氮（NO）并分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和IL-6等一系列細(xì)胞因子抵御病原體入侵，從而保護(hù)宿主免受病原體的侵害[3-6]。因此，巨噬細(xì)胞激活是宿主提高免疫能力的重要機(jī)制。隨著人們健康意識(shí)的提高，膳食營養(yǎng)已經(jīng)成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。作為傳統(tǒng)主食，谷物在我國膳食系統(tǒng)中占有重要地位。其中，谷物蛋白資源豐富、價(jià)格低廉，具有改善心血管疾病、降低膽固醇水平和減少癌癥發(fā)病率等生理功能，被廣泛用于食品工業(yè)中[7-8]。

大豆是中國最重要的谷物糧食之一，大豆中的蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%左右，并且氨基酸組成全面，是優(yōu)質(zhì)植物蛋白的重要來源[9]。大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種廉價(jià)、高營養(yǎng)的谷物蛋白，但較差的功能性質(zhì)削弱了其生理活性[10-11]。杏鮑菇多糖（Pleurotus eryngii polysaccharide，PEP）是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，具有降血壓、降血脂、抗炎癥和抗腫瘤等生理功能[12-14]。此外，它能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)細(xì)胞吞噬病原體的能力，從而實(shí)現(xiàn)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]。糖基化是一種基于美拉德反應(yīng)的化學(xué)修飾方法，能使蛋白與糖類共價(jià)結(jié)合，從而改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和生物活性[18]。Jing等[19]利用美拉德反應(yīng)制備了一種酪蛋白-葡萄糖共價(jià)結(jié)合物，與單一的酪蛋白或葡萄糖及兩者的混合物相比，這種結(jié)合物的還原能力和自由基清除活性更強(qiáng)，具有出色的抗氧化活性。張小沛等[20]發(fā)現(xiàn)五味子葉多糖與氨基酸共價(jià)結(jié)合物的抗氧化能力與糖基化反應(yīng)時(shí)間在一定范圍內(nèi)成正比。此外，研究表明，基于美拉德反應(yīng)的蛋白-多糖共價(jià)結(jié)合物具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[21]。在前期研究中，本課題組利用美拉德反應(yīng)制備了一種大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖共價(jià)結(jié)合物（soybean protein isolate-P. eryngii polysaccharide conjugate，W-PP），發(fā)現(xiàn)這種結(jié)合物具有較強(qiáng)的蛋白功能性質(zhì)——乳化性、水溶性和熱穩(wěn)定性。然而，關(guān)于W-PP的生物活性——免疫調(diào)節(jié)作用還未深入研究。

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7是體外研究功能成分免疫調(diào)節(jié)作用的理想模型，本實(shí)驗(yàn)基于RAW264.7細(xì)胞，以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）為陽性對(duì)照，SPI、PEP和大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖混合物（mixture of soybean protein isolate and P. eryngii polysaccharide，PP）為樣品對(duì)照，研究W-PP對(duì)巨噬細(xì)胞的活力、中性紅吞噬活性、NO釋放量、細(xì)胞因子分泌及其mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)而評(píng)價(jià)這種共價(jià)結(jié)合物的免疫調(diào)節(jié)活性，以期為后續(xù)進(jìn)一步的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕 西亞化工有限公司；杏鮑菇超微粉 江蘇芝慶堂生物科技有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 上海瑞鹿生物科技有限公司復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心；RPMI1640 美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、雙抗（青、鏈霉素）、胎牛血清、LPS、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）和1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶公司；中性紅試劑盒、NO檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（TNF-α、IL-6、IL-1β） 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax-190酶標(biāo)儀 美國Biorad公司；T18高速分散機(jī) 德國IKA公司；J-50氣流粉碎機(jī) 意大利Tenologia Meccanica公司；Allegra 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)美國Beckman公司；TP600型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 日本Takara公司；Lightcycle K熒光定量PCR儀 杭州BIOER公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

S P I制備工藝：低溫脫脂豆粕打粉，2 0 0 目過篩得到低溫脫脂豆粉。將豆粉和水按照1∶10（m/V）的比例溶解豆粕，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，常溫?cái)嚢? h，離心（10 000×g、20 min、4 ℃）得到上清液，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5。在4 ℃下5 000 ×g離心5 min得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～10%干物質(zhì)，再用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，4 ℃透析24 h，冷凍干燥后得到自制SPI。

1.3.2 PEP的提取

取杏鮑菇超微粉，按液料比10∶1～50∶1（V/m）加入蒸餾水，在60～100 ℃水浴加熱條件下浸提3 h。浸提液4 000 ×g離心20 min取上清液，然后采用Sevag試劑（V（三氯甲烷）：V（正丁醇）＝4∶1）法去上清液蛋白，離心（10 000×g、10 min）向上清液中加入4 倍體積無水乙醇，在4 ℃下沉淀過夜，4 500×g離心10 min取沉淀，冷凍干燥，得到樣品PEP。

將SPI和PEP按照質(zhì)量比1∶1混合得到大豆分離蛋白-杏鮑菇多糖混合組（PP）。

1.3.3 濕熱法處理SPI和PEP

將前期制備好的SPI和PEP按照質(zhì)量比1∶1混合并配成質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的溶液，磁力攪拌器混合均勻，在4 ℃下水化過夜。然后將樣品置于80 ℃水浴鍋中加熱3 h，并在4 ℃條件下10 000×g離心10 min。取上清液，冷凍干燥，獲得W-PP。于－20 ℃下貯存，待作進(jìn)一步分析。

1.3.4 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7于RPMI1640完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）中生長，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時(shí)進(jìn)行傳代，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 MTT法檢測細(xì)胞活力

采用MTT法[22]檢測細(xì)胞活性。將對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞按照約1×106個(gè)/mL的密度接種于96 孔板中，100 μL/孔，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至80%細(xì)胞貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，設(shè)置不接種細(xì)胞的空白組，對(duì)照組加入100 μL完全培養(yǎng)液，樣品組分別加入不同樣品溶液各100 μL。其中，樣品組包括不同質(zhì)量濃度（0～400 μg/mL）的SPI、PEP、PP和W-PP溶液（以單純的RPMI1640為溶劑配制），每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，24 h后棄去上清液，每孔加入30 μL MTT（5 mg/mL）工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去MTT工作液，每孔加入DMSO 100 μL，于搖床避光搖晃15 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按照下式計(jì)算細(xì)胞活力。

式中：A0為空白組吸光度；A1為對(duì)照組吸光度；A2為樣品組吸光度。

1.3.6 中性紅法檢測細(xì)胞吞噬能力的測定

將RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于96 孔板中培養(yǎng)7 h，設(shè)置不含樣品的空白對(duì)照組（200 μL的RPMI1640完全培養(yǎng)液）、LPS組（1 μg/mL，200 μL），并基于1.3.5節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定細(xì)胞活力最佳的3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度（25、50、100 μg/mL，200 μL）的樣品組（SPI、PEP、PP和W-PP）。培養(yǎng)12 h后，按照中性紅試劑盒的操作方法，棄去上清液，每孔加入100 μL體積分?jǐn)?shù)為0.075%中性紅溶液染色，繼續(xù)培養(yǎng)3 h棄去上清液，PBS洗滌3 次后每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，室溫?fù)u床裂解10 min，在540 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 NO釋放量的測定

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL密度接種于96 孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，待80%以上細(xì)胞貼壁后，吸去完全培養(yǎng)液并用PBS清洗3 次?？瞻讓?duì)照組加入200 μL的RPMI1640完全培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入200 μL LPS溶液（1 μg/mL），樣品組分別加入25、50、100 μg/mL的SPI、PEP、PP和W-PP溶液各200 μL，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后收集上清液，按照NO測定試劑盒的操作說明測定細(xì)胞NO釋放量。

1.3.8 TNF-α、1L-1β和IL-6濃度的測定

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，按1.3.7節(jié)中的方法處理各組后培養(yǎng)24 h，收集上清液，參照IL-6、1L-1β和TNF-α的ELISA試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞上清液中各細(xì)胞因子的濃度。

1.3.9 TNF-α、1L-1β和IL-6的mRNA水平測定

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×106個(gè)/mL，接種于6 孔板，每孔2 mL細(xì)胞懸液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，待80%以上細(xì)胞貼壁后，吸去完全培養(yǎng)液并用PBS清洗3 次?？瞻讓?duì)照組加入2 mL的RPMI1640完全培養(yǎng)液，LPS組加入2 mL LPS溶液（1 μg/mL），樣品組分別加入2 mL 25、50、100 μg/mL的PEP和W-PP。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞沉淀1 遍，收集細(xì)胞提取RNA。采用實(shí)時(shí)熒光PCR法測定細(xì)胞中TNF-α、1L-1β和IL-6的mRNA水平。具體操作步驟如下[23-24]。1）組織勻漿：向各樣品中加入1 mL的TRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打；2）將上述勻漿液室溫放置5 min，待核酸和蛋白充分解離。向勻漿液中加入0.2 mL氯仿，蓋緊管蓋，手動(dòng)劇烈振搖15 s，然后室溫靜置2～3 min；3）4 ℃、10 000×g離心10 min；4）小心吸取上層水相（無色）加入到新試管中，同時(shí)記錄所吸取的水相體積；5）加入所吸取水相等體積預(yù)冷的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖勻；6）室溫靜置10 min，待RNA充分沉淀；7）4 ℃、10 000×g離心10 min；8）將上清液棄除，保留沉淀，每管加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液潤洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動(dòng)離心管，以去除殘留的異丙醇和鹽分。4 ℃、7 500×g離心5 min；9）將上清液棄除，打開管蓋，將RNA沉淀干燥（室溫?fù)]發(fā)或真空干燥）。注意RNA沉淀不可完全干燥，否則難以溶解；10）將RNA沉淀溶解于適量的無RNase水中。采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并用GelStain染色。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，且P＜0.05表示數(shù)據(jù)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

圖1 SPI、PEP、PP和W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig. 1 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on cell viability in RAW 264.7 cells

如圖1所示，與空白對(duì)照組相比，不同樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活力產(chǎn)生一定影響。當(dāng)質(zhì)量濃度為2～50 μg/mL時(shí)，SPI、PEP、PP和W-PP 4 種樣品對(duì)細(xì)胞活力均無顯著影響（P＞0.05），表明4 種樣品質(zhì)量濃度在2～50 μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞沒有毒性。SPI、PEP、PP質(zhì)量濃度為100～400 μg/mL，W-PP質(zhì)量濃度為200～4 0 0 μ g/m L時(shí)，細(xì)胞活力呈顯著降低的趨勢（P＜0.05），表明過高質(zhì)量濃度的樣品對(duì)細(xì)胞毒性較大，從而降低其活力[25]。因此，綜合細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇25、50 μg/mL和100 μg/mL這3 個(gè)質(zhì)量濃度梯度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理，并在此質(zhì)量濃度下，評(píng)價(jià)W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

2.2 W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬活性的影響

圖2 SPI、PEP、PP和W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬活性的影響Fig. 2 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on phagocytic activity in RAW264.7 cells

中性紅法可以用來評(píng)價(jià)RAW264.7細(xì)胞的吞噬功能[26]。如圖2所示，LPS組作為陽性對(duì)照，經(jīng)LPS刺激后，RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬能力顯著加強(qiáng)（P＜0.05）。隨著質(zhì)量濃度的上升，SPI對(duì)RAW264.7細(xì)胞的中性紅吞噬能力無顯著影響，PEP、PP的中性紅吞噬活性在質(zhì)量濃度為50、100 μg/mL時(shí)分別達(dá)到最大值。而W-PP對(duì)細(xì)胞中性紅吞噬活性呈顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），在100 μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)中性紅吞噬活性達(dá)到空白對(duì)照組的2.05 倍，說明糖基化SPI可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)外來物質(zhì)的吞噬作用，從而保護(hù)機(jī)體免受病原體侵蝕，提高機(jī)體免疫力。

2.3 W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO濃度的影響

圖3 SPI、PEP、PP、W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO濃度的影響Fig. 3 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on the production of nitric oxide in RAW 264.7 cells

研究表明，巨噬細(xì)胞被激活后生成NO，并與超氧陰離子自由基反應(yīng)形成過氧亞硝基陰離子，協(xié)助機(jī)體對(duì)抗外來抗原，實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[27-28]。如圖3所示，與空白對(duì)照組相比，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后NO分泌量顯著增加（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，SPI和PEP處理后細(xì)胞NO釋放量無顯著差異（P＞0.05）。而當(dāng)PP、W-PP在質(zhì)量濃度為50 μg/mL和100 μg/mL時(shí)，NO釋放量隨著質(zhì)量濃度的升高而上升，并且都在100 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，說明PP、W-PP樣品在一定質(zhì)量濃度下可激活并提高巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌NO的能力。

2.4 W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度及其mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 SPI、PEP、PP、W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C）分泌量的影響Fig. 4 Effects of SPI, PEP, PP and W-PP on the secretion of TNF-α (A),IL-1β (B) and IL-6 (C) in RAW 264.7 cells

RAW264.7細(xì)胞總RNA提取電泳結(jié)果如圖5所示。LPS、PEP、W-PP各組RNA條帶清晰，表明成功提取RNA。

圖5 RAW264.7細(xì)胞總RNA提取電泳圖Fig. 5 Electropherogram of total RNA extracts from RAW264.7 cells

圖6 PEP和W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α（A）、IL-1β（B）和IL-6（C） mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 6 Effects of PEP and W-PP on gene expression of TNF-α (A),IL-1β (B) and IL-6 (C) in RAW 264.7 cells

巨噬細(xì)胞受到刺激后會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子，它是一類具有調(diào)控免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生長和損傷組織修復(fù)等功能的小分子可溶性蛋白[29-31]。巨噬細(xì)胞被激活后可以分泌白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子傳導(dǎo)并調(diào)控免疫通路[32]。如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，LPS組的TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度顯著上升。與空白對(duì)照組相比，SPI和PP對(duì)細(xì)胞因子分泌量沒有顯著影響（P＞0.05），而PEP在較高質(zhì)量濃度下對(duì)TNF-α（＞50 μg/mL）和IL-1β、IL-6（＞100 μg/mL）的質(zhì)量濃度具有顯著促進(jìn)作用。PEP組的TNF-α、IL-1β和IL-6質(zhì)量濃度較PP組更高，說明在高質(zhì)量濃度下PEP對(duì)細(xì)胞因子的分泌有促進(jìn)作用。W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞因子分泌具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用且存在劑量依賴效應(yīng)，質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)表現(xiàn)出最佳的免疫調(diào)節(jié)活性（P＜0.05）。此外，與空白對(duì)照組相比，在一定質(zhì)量濃度下PEP和W-PP均能顯著提高IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量，且存在劑量依賴效應(yīng)（圖6），其中共價(jià)結(jié)合物上調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)的能力最強(qiáng)。

在非炎癥巨噬細(xì)胞模型中，細(xì)胞因子的分泌水平可以作為評(píng)估免疫激活和調(diào)節(jié)能力的指標(biāo)[33]。其中，白細(xì)胞介素（IL-1β和IL-6）和TNF-α能夠輔助機(jī)體清除外源性抗原和異常細(xì)胞，并與T細(xì)胞協(xié)同作用，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答[34-35]。與W-PP相比，單一的SPI及其與PEP的混合物在培養(yǎng)液中的溶解度較低，導(dǎo)致它們在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收效率下降，影響其免疫調(diào)節(jié)作用。此外，美拉德反應(yīng)引入的PEP穩(wěn)定了SPI的空間結(jié)構(gòu)，糖鏈的引入提高了SPI的溶解性和抗氧化活性，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用[36-38]。由此可知，W-PP能通過提高RAW264.7細(xì)胞的IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量及其mRNA表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了W-PP對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力、中性紅吞噬活性、NO釋放量、細(xì)胞因子分泌及其mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，W-PP在25～100 μg/mL范圍變化時(shí)，能顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬能力、NO釋放量和細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）質(zhì)量濃度。此外，PEP和W-PP能顯著提高這3 種細(xì)胞因子的mRNA水平，其中100 μg/mL W-PP對(duì)細(xì)胞因子mRNA水平的上調(diào)作用最強(qiáng)。由此可得，W-PP具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，說明糖基化反應(yīng)可以增強(qiáng)SPI的生物活性。