張瑞明，劉夢霞，王 祎，劉曉輝，于景華,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，北京 101107）

乳脂肪是牛乳的主要成分之一，在體系中以脂肪球的形式存在[1-2]。脂肪球表面由成分復雜的脂肪球膜[3]包裹，脂肪球膜主要由蛋白質、脂類等組成[4]，這些蛋白質以及脂類具有重要的功能[5]。在貯存過程中，脂肪球一直進行不規(guī)則的布朗運動，由于熱運動相互碰撞時，在脂肪球膜處會發(fā)生相互滲透，導致脂肪球之間相互融合，進而形成更大的脂肪球[6]，由于重力沉降作用和油-水界面密度差，便會產生脂肪上浮現(xiàn)象，最終影響產品品質與貨架期。

脂肪球的粒徑大小可以反映脂肪穩(wěn)定性，通常脂肪球的平均直徑小于0.8 μm時，其上浮速度慢[7]。減小脂肪球直徑常用的方法是均質，在均質過程中，通過湍流、剪切力和氣穴現(xiàn)象的作用，使得脂肪球直徑迅速變小[8]。均質壓力需要適當[9]，因為均質會導致脂肪球膜上蛋白含量、種類以及結合方式發(fā)生變化[10]，從而影響牛乳的膠體和功能特性[11]。

脂肪球膜蛋白在乳相中含量極少[12-13]，通過蛋白質組學方法鑒定出蛋白質的種類有500多種[14]。豐度最高的有8 種[15]，其中6 種是糖蛋白，包括黏液素1、黃嘌呤氧化還原酶、黏液素15（又稱組織糖蛋白高碘酸薛夫III）、組織糖蛋白高碘酸薛夫IV（cluster of differentiation 36，CD36）、嗜乳脂蛋白和乳凝集素（又稱組織糖蛋白高碘酸薛夫6/7）[16]，另外兩種都是分子質量更小的非糖基化蛋白，分別為脂肪分化相關蛋白和脂肪酸結合蛋白[17-18]。這些蛋白雖然量少，卻具有重要的功能，如黃嘌呤氧化還原酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，XO）在乳腺的發(fā)育、腸道的抗菌和組織損傷中具有一定的作用[19]。嗜乳脂蛋白（butyrophilin，BTN）具有免疫調節(jié)作用[20-21]等。同時這些蛋白對維持體系的穩(wěn)定性也發(fā)揮著不可忽視的作用，本實驗通過研究在不同均質條件下脂肪球膜蛋白組分的變化，并與天然脂肪球膜蛋白的組成進行比較，確定形成乳穩(wěn)定體系所需脂肪球膜蛋白組成，以期為生產中均質工藝參數(shù)調整，提高乳體系穩(wěn)定性，改善純乳制品的貨架期內脂肪上浮的缺陷提供可靠的理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)過標準化處理的鮮牛乳 滄興牧業(yè)有限公司。

氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、咪唑、乙醇、乙二胺四乙酸、硫酸銅、硫酸鉀（均為分析純）天津市化學試劑一廠；氯化鉀（分析純） 天津市景田化工有限公司；硼酸（分析純） 天津市百世化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（純度＞93%） 美國Genview公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；甲酸（純度＞93%） 上海紫一試劑廠；乙腈（色譜純） 天津賽孚瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；FE20Mettler pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TDZ5-WS離心機、臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；752紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；BSA124S電子天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；DYCZ-24DN型電泳儀 北京六一儀器廠；DL-600C電泳儀電源 北京東林昌盛生物科技有限公司；TW-Basic均質機 上海沃迪自動化裝備股份有限公司；Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀 法國Formulation公司。

1.3 方法

1.3.1 巴氏殺菌乳的制備

將標準化的鮮牛乳置于水浴鍋中預熱，在固定均質壓力的條件下設置不同的預熱溫度，分別為50、60、70 ℃；在固定預熱溫度的條件下設置不同的均質壓力，分別為20、30、40、45 MPa；均質后于水浴鍋中滅菌，條件為75 ℃、15 s[22]；滅菌后于冰水浴中快速降溫后置于4 ℃貯存。

1.3.2 巴氏殺菌乳穩(wěn)定性系數(shù)的測定

采用Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀對樣品進行穩(wěn)定性測試。對于透明體系，選取透射光的透過率為指標，不透明體系則選取背散射光的反射率為指標（巴氏殺菌乳屬于不透明體系，因此選擇的穩(wěn)定性評價指標為反射率）。穩(wěn)定分析儀給出的評價指標是樣品觀察時間內背散射光的平均變化率，也稱穩(wěn)定性系數(shù)（dynamic stability index，TSI）。TSI與體系的穩(wěn)定性呈負相關，即TSI越小，體系越穩(wěn)定；TSI越大，體系越不穩(wěn)定。

測量時，取樣品約20 mL加入樣品池，加蓋后置于儀器的樣品槽中，設定60 min掃描一次，共掃描7 h，即可直接得到樣品的TSI。

1.3.3 乳脂肪球膜蛋白的提取

乳脂肪球膜蛋白的提取方法參考Le[23]和Zamora[24]等的方法并略作修改。將牛乳預熱至3 6 ℃后，4 000 r/min離心25 min收集上層乳脂；再用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，以去除脫脂乳中的酪蛋白（casein，CN）、乳清蛋白（lactalbumin，La）、乳糖。PBS與乳脂肪以5∶1（V/V）混合，39 ℃輕微振蕩水浴30 min后，4 000 r/min離心30 min后收集上層乳脂；PBS重復洗滌乳脂兩次，再用蒸餾水洗滌一遍；將洗滌干凈的乳脂與SDS-Tris溶液1∶1（m/m）混合，60 ℃輕微振蕩水浴30 min后，4 ℃、5 000×g離心15 min，下層液體即為含有乳脂肪球膜蛋白的樣品。

1.3.4 乳脂肪球膜蛋白質的SDS-PAGE定性分析

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）參照de Feijter等[25]的方法，采用質量分數(shù)12%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE分析，還原膠與非還原膠的配制參照趙亭亭等[26]的方法。

1.3.5 液相色譜-質譜法測定乳脂肪球膜蛋白組成及含量

1.3.5.1 蛋白質定量

使用8 mol/L尿素復溶1.3.3節(jié)中提取的乳脂肪球膜蛋白樣品，用考馬斯亮藍法對待測樣品進行蛋白質量濃度測定：1）標準曲線的制作：配制0.1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液，進行標準曲線的制作[27]。2）蛋白質含量的測定：取1 mL待測洗液與5 mL考馬斯亮藍G-250顯色劑混合均勻，靜置5 min后于595 nm波長處測吸光度，20 min內測完。調整洗液中蛋白質量濃度，使所有樣品蛋白質量濃度均為3 mg/mL，備用。

1.3.5.2 SDS-PAGE鑒定溶解效果

SDS-PAGE方法同1.3.4節(jié)。

1.3.5.3 FASP法酶解蛋白質

液相色譜-質譜（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）聯(lián)用的樣品采用超濾輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP）法[28-29]酶解處理。從1.3.3節(jié)提取的脂肪球膜蛋白樣品中取出100 μg蛋白質使用FASP法進行蛋白質酶解，具體步驟如下：向樣品中加入與蛋白樣品相同體積的8 mol/L尿素；加入DL-二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），使DTT終濃度達到10 mmol/L，然后在37 ℃條件下反應2.5 h；加入碘乙酰胺（iodoracetamide，IAA）至終濃度50 mmol/L，避光反應40 min；轉至3K超濾管中12 000×g下離心，之后棄掉濾液；加入400 μL 8 mol/L尿素，12 000×g下離心，棄掉濾液，重復兩次；向超濾管中加入400 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液，12 000×g下離心，棄掉濾液，重復3 次。向超濾管中加入200 μL 50 mmol/L碳酸氫銨溶液；向超濾管中以m（樣品）∶m（酶）＝50∶1加入胰蛋白酶，于37 ℃搖床酶解16 h；在4 ℃、12 000×g條件下離心，收集濾液，冷凍干燥。

1.3.5.4 LC-MS/MS檢測參數(shù)及樣品編號

采用Nano Acquity高效液相色譜，色譜柱：C18（15 cm×75 μm，3 μm）；分離條件：上樣量為2 μg；流動相A為0.1%（體積分數(shù)，后同）甲酸-水溶液；流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脫，0～10 min 95% A，10～140 min 90% A，140～158 min 70% A，158～160 min 55% A，160～165 min 5% A，165～180 min 95% A；流速400 nL/min。

串聯(lián)質譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）分析采用Scientific Q Exactive質譜儀；噴霧電壓：2.0 kV；毛細管溫度：320 ℃；S-lens RF水平：55；分辨率：一級70 000，m/z 200，二級17 500，m/z 200；母離子掃描范圍：m/z 300～1 800，子離子從m/z 100開始掃描；MS1 AGC目標：3e6，離子注入時間：60 ms，MS2 AGC目標：5e4，離子注入時間：80 ms；離子篩選窗口：2.2 m/z；碎裂模式：HCD；能量NCE 27；Data-dependent MS/MS：Top 20；動態(tài)排除時間：30 s。

取6 個巴氏殺菌乳樣品進行LC-MS/MS檢測，其樣品編號和相應制備方法為：L1（預熱溫度60 ℃、均質壓力20 MPa）、L2 （預熱溫度60 ℃、均質壓力30 MPa）、L3（預熱溫度60 ℃、均質壓力40 MPa）、 L4（預熱溫度60 ℃、均質壓力45 MPa）、L5 （預熱溫度50 ℃、均質壓力40 MPa）、L6（預熱溫度70 ℃、均質壓力40 MPa）。

1.3.5.5 LC-MS/MS蛋白質組學分析

使用蛋白質組學分析軟件Proteome Discoverer 2.1對采集的數(shù)據(jù)進行蛋白質定性與定量分析，檢索數(shù)據(jù)庫采用Uniprot網(wǎng)站下載的Bos Taurus全庫（數(shù)據(jù)庫編號9913），同時為了去除假陽性結果，數(shù)據(jù)檢索采用正反庫檢索策略，檢索結果在多肽層次采用偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤1%篩選條件，在蛋白層次采用Q Value≤1%的篩選條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Turbiscan Lab全能穩(wěn)定分析儀的TLAB EXPERT軟件采集數(shù)據(jù)，采用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)，并用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)擬合和作圖。

2 結果與分析

2.1 不同均質工藝條件對巴氏殺菌乳TSI的影響

圖1 不同預熱溫度對乳脂肪TSI的影響Fig. 1 Effect of different preheating temperatures on turbiscan stability index of milk fat

TSI與樣品穩(wěn)定性呈負相關，即TSI越大表示樣品穩(wěn)定性越差。由圖1可以看出，不同均質壓力下，預熱溫度分別為50、60 ℃和70 ℃時，60 ℃巴氏殺菌乳的脂肪穩(wěn)定性均表現(xiàn)最好。

圖2 不同均質壓力對乳脂肪TSI的影響Fig. 2 Effect of different homogenization pressures on turbiscan stability index of milk fat

由圖2可以看出，不同預熱溫度下，均質壓力分別為20、30、40 MPa和45 MPa時，40 MPa巴氏殺菌乳總體脂肪穩(wěn)定性最好。

因此，從TSI來判斷，預熱溫度60 ℃、均質壓力40 MPa時，巴氏殺菌乳脂肪穩(wěn)定性最好。

2.2 乳脂肪球膜蛋白質的SDS-PAGE定性分析結果

由圖3可知，生牛乳中XO、CD36、BTN在非還原條件下不存在，在還原條件（添加β-巰基乙醇）下出現(xiàn)，說明這些脂肪球膜蛋白可能是通過二硫鍵作用力結合在脂肪球膜上；泳道2樣品XO、CD36、BTN、ADPH在非還原條件下不存在，而在還原條件下存在，說明XO、CD36、BTN、ADPH這些蛋白通過二硫鍵形式結合存在；與泳道1樣品對比可知，預熱后均質導致部分CN、La參與了脂肪球膜蛋白的組成，這與Ye Aqian等[30]的結論一致。而且均質后，αs1-CN、β-CN的含量明顯增多，這可能是其參與了脂肪球膜的再構建，對再構建體系的穩(wěn)定性發(fā)揮作用。經(jīng)過均質處理的泳道3～8樣品在非還原條件下存在XO、BTN、ADPH，與泳道1、2樣品對比，可能是均質導致一部分XO、BTN、ADPH之間的二硫鍵作用力減弱，以非二硫鍵作用力存在于脂肪球膜上。非還原條件下的泳道1～8樣品，在濃縮膠的上樣孔處和濃縮膠與分離膠分界處有明顯的大分子物質堆積；而在還原條件下，僅泳道1、2樣品有大分子物質堆積，泳道3～8樣品沒有大分子物質堆積，證明未均質的牛乳脂肪球膜蛋白之間除了二硫鍵作用力外，還有其他的連接方式，使其成為大分子復合物，在均質后這種作用力被消除。

圖3 牛乳脂肪球膜蛋白質SDS-PAGE分析圖譜Fig. 3 SDS-PAGE patterns of MFGM proteins under non-reducing and reducing conditions

2.3 LC-MS/MS檢測乳脂肪球膜蛋白結果

2.3.1 蛋白質組學分析結果

表1 不同均質工藝條件處理的巴氏殺菌乳脂肪球膜LC-MS/MS鑒定的蛋白總數(shù)量Table 1 Number of MFGM proteins identified by LC-MS/MS from different homogenized pasteurized milks

通過LC-MS/MS蛋白質組學分析方法，檢測不同均質工藝條件對脂肪球膜蛋白種類的影響。由表1、圖4可知，L1～L6樣品總共檢測到蛋白質467 個，比較L1～L4樣品，預熱溫度60 ℃，不同均質壓力的脂肪球膜蛋白種類數(shù)目接近，差異蛋白數(shù)量較少，分別為41、32、11、13 個，因此影響脂肪穩(wěn)定性的蛋白主要表現(xiàn)在特定蛋白質的含量差異上。比較L3、L5、L6樣品，均質壓力為40 MPa時不同預熱溫度處理的脂肪球膜蛋白種類數(shù)目有差異，隨著預熱溫度的升高蛋白種類減少，分別為27、91、7。但是通過基因本體論（gene ontology，GO）注釋分析，差異蛋白的分子功能并無特異性，有結合功能的蛋白質在3 種樣品中都存在，因此影響脂肪穩(wěn)定性的蛋白主要表現(xiàn)在特定蛋白質的含量差異上。

圖4 不同均質壓力處理的巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白（A）和不同預熱溫度處理的巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白（B）韋恩圖Fig. 4 Venn diagrams for MFGM proteins in pasteurized milk treated at different homogenization pressures (A) and temperatures (B)

2.3.2 牛乳脂肪球膜蛋白構成LC-MS/MS分析結果

圖5 不同預熱溫度對高豐度（A）和低豐度（B）再構建乳脂肪球膜蛋白的影響Fig. 5 Effects of different preheating temperatures on composition of high- (A) and low-abundance (B) reconstituted MFGM proteins

由圖5可知，預熱溫度60 ℃時，XO、BTN、ADPH、乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）、β-lg、κ-CN、αs2-CN這幾種蛋白質含量最低，可能是這幾種脂肪球膜蛋白在預熱60 ℃時的結合力最弱，在提取脂肪球膜蛋白過程中損失最多，Lf、β-lg、κ-CN、αs2-CN這幾種蛋白質在預熱60 ℃時結合到脂肪球膜上的量最少；MUC1、αs1-CN、β-CN、BSA在預熱60 ℃時的含量最高，說明脂肪球膜蛋白MUC1在預熱60 ℃時的結合力最強，最穩(wěn)定，而αs1-CN、β-CN、BSA結合到脂肪球膜上的量最多，結合最穩(wěn)定，結合2.1節(jié)穩(wěn)定性分析結果推測，可能是αs1-CN、β-CN、BSA參與了脂肪球膜的再構建，對脂肪球穩(wěn)定性起到關鍵作用；FABP、PAS6/7、Ig的含量隨著預熱溫度的升高而減少，說明脂肪球膜蛋白FABP、PAS6/7有熱不穩(wěn)定性，溫度升高后結合力減弱導致有所損失，而結合到膜上的Ig會隨著溫度的升高而脫落。α-La、CD36的含量隨著預熱溫度的升高而增多，說明脂肪球膜蛋白CD36隨著預熱溫度的升高結合作用力更穩(wěn)定，CD36隨預熱溫度的升高損失得越少，而α-La隨著溫度的升高結合到脂肪球膜上的量增多。通過蛋白豐度的變化分析可知，預熱處理后脂肪球膜被破壞，會有部分膜組分流入乳相，同時也有乳蛋白結合到膜上。

圖6 不同均質壓力對高豐度（A）和低豐度（B）再構建乳脂肪球膜蛋白的影響Fig. 6 Effect of different homogenizations pressures on composition of high- (A) and low-abundance (B) reconstituted MFGM proteins

由圖6可知，4 種樣品中的XO、PAS6/7、BTN、ADPH、FABP、Lf和β-lg這7 種蛋白質含量的變化趨勢一致，隨均質壓力的增大，先減少而后增加，且在均質壓力40 MPa時蛋白質含量最低。由2.1節(jié)結果可知，40 MPa時的巴氏殺菌乳脂肪是最穩(wěn)定的，說明這些蛋白在此壓力下含量最適宜，可能是這些蛋白此時能夠與其他蛋白相互作用達到最佳作用效果，使得脂肪球最穩(wěn)定；XO和BTN兩種蛋白質含量變化趨勢一致，也證明了Mulder[31]的結論：XO和BTN之間通過二硫鍵作用力形式結合存在。Lf、β-lg與XO、PAS6/7、BTN、ADPH、FABP的變化趨勢一致；而BSA在均質壓力40 MPa時含量最高（圖6A），因此BSA可能是影響脂肪穩(wěn)定性的關鍵因素；α-La和CD36這兩種蛋白隨著均質壓力的增加而減少（圖6B），說明均質破壞了這兩種蛋白的結合作用力，使其容易從膜上脫落損失。

3 結 論

通過測定TSI確定了在預熱溫度為60 ℃、均質壓力為40 MPa時的巴氏殺菌乳脂肪穩(wěn)定性最佳。通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，XO、CD36、BTN、ADPH通過二硫鍵作用力存在于脂肪球膜上；均質處理導致一部分XO、BTN、ADPH蛋白質之間的二硫鍵作用力減弱，以非二硫鍵作用力作用形式存在于脂肪球膜上；預熱和均質處理會導致CN、La參與脂肪球膜的組成；未均質的牛乳脂肪球膜蛋白之間除了有二硫鍵作用力以外，還有其他的連接方式，使這些蛋白質成為大分子復合物，而均質后這種作用力被消除。

通過LC-MS/MS蛋白質組學分析方法檢測不同均質工藝條件對脂肪球膜蛋白種類的影響：預熱溫度50～70 ℃、均質壓力20～45 MPa范圍內，均質壓力對巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白種類無顯著影響；預熱溫度對巴氏殺菌乳脂肪球膜蛋白種類有影響，但這些差異蛋白無特殊分子功能。因此影響脂肪穩(wěn)定性的蛋白主要表現(xiàn)在特定蛋白質的含量差異上。

通過LC-MS/MS鑒定分析不同均質工藝處理的乳脂肪球膜蛋白含量變化情況：在均質壓力40 MPa、預熱溫度60 ℃時，XO、BTN、ADPH、Lf、β-lg、κ-CN、αs2-CN這幾種蛋白質的結合力最弱；而MUC1、αs1-CN、β-CN、BSA的結合最穩(wěn)定，說明這幾種蛋白質對脂肪球膜穩(wěn)定性方面起到關鍵作用；脂肪球膜蛋白FABP、PAS6/7具有熱不穩(wěn)定性；脂肪球膜蛋白CD36隨著預熱溫度的升高結合作用力更穩(wěn)定，而α-La隨著溫度的升高結合到脂肪球膜上的量增多；XO和BTN之間通過二硫鍵作用力形式結合存在；BSA在均質壓力40 MPa時含量最高，可能是影響脂肪穩(wěn)定性的關鍵因素。