朱孝揚(yáng)，李秋棉，羅 均，陳維信，陸旺金，李雪萍*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方園藝產(chǎn)品保鮮教育部工程研究中心，廣東省果蔬保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

香蕉是我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)大量栽培的水果之一，栽培品種除香牙蕉（屬AAA群）外，還有大蕉、粉蕉（屬ABB群）等特色品種。粉蕉（Musa ABB Pisang Awak）是芭蕉屬的一個(gè)香蕉雜交栽培種，其果實(shí)外型美觀、果肉質(zhì)地柔滑口感好、風(fēng)味特別，廣受種植者和消費(fèi)者喜愛(ài)。但是，粉蕉果實(shí)采后貨架期短、不耐貯藏，容易腐爛劣變[1]。

果實(shí)香氣成分的變化不但是衡量果實(shí)采后貯藏及貨架壽命的重要指標(biāo)之一，也是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的一個(gè)重要因素。目前已知香蕉果實(shí)的香氣成分有230 種以上，多為酯類、醇類和羰基化合物[2]。產(chǎn)于海南?？诘南憬豆麑?shí)中，主要的揮發(fā)性物質(zhì)為酯類與酸類，還有少量的烷烴、烯烴、醇和酮類。其中，含量較高的有異戊酸2-甲基丁酯、丁酸異戊酯、丁酸己酯、亞油酸、丁酸丁酯和己酸異戊酯[3]。產(chǎn)于廣州的巴西香蕉，綠熟階段香蕉揮發(fā)性物質(zhì)中絕大部分是醛類；完熟階段酯類成分的比例明顯增加，其中乙酸酯和丁酸酯是兩類主要成分；隨著香蕉由完熟向過(guò)熟階段轉(zhuǎn)變，酯類成分的比例發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)在乙酸酯類比例下降，同時(shí)丁酸酯類比例增加[4]。影響香蕉香氣差異的因素很多，包括蕉類品種、種植區(qū)域和方式、采收時(shí)果實(shí)的飽滿度和貯藏方式等[5]。而關(guān)于粉蕉成熟過(guò)程中香氣物質(zhì)變化及調(diào)控的研究報(bào)道較少[6]。

果實(shí)中香氣物質(zhì)的合成，主要通過(guò)脂肪酸氧化途徑與氨基酸代謝途徑[7]，這兩個(gè)途徑中參與代謝的酶很多。在氨基酸代謝途徑中，支鏈氨基酸在氨基酸轉(zhuǎn)移酶（branched-chain amino acid transaminase，BCAT）的作用下生成支鏈酮，然后在丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase，PDC）的作用下生成支鏈的醛，醛在醇脫氫酶（pyruvate decarboxylase，ADH）的作用下生成醇，醇與?；o酶A在醇?；D(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AAT）的作用下生成相應(yīng)的酯類[8]。在此途徑中，BCAT是支鏈酮生成的關(guān)鍵酶。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）參與了以脂肪酸為前體的直鏈酯的合成[9]。LOX催化亞油酸、亞麻酸產(chǎn)生C6、C9化合物（如己醇、己醛、己烯醛、壬醛、壬烯醛等）[9]。在蘋(píng)果中，隨著果實(shí)的成熟，香氣合成相關(guān)基因LOX、HPL、ADH、PDC2、AAT、BACT等的表達(dá)都顯著上調(diào)，而1-MCP處理顯著延緩了果實(shí)成熟，抑制了這些香氣合成相關(guān)基因的表達(dá)[10]。在香蕉果實(shí)中，這些基因在果實(shí)成熟過(guò)程中表達(dá)顯著上調(diào)，與香氣合成呈現(xiàn)密切的正相關(guān)關(guān)系[11]。上述研究結(jié)果都表明這些基因在果實(shí)香氣合成中起著重要的作用。

雖然果實(shí)成熟過(guò)程香氣成分分析及香氣合成的分子機(jī)理在多種水果上已經(jīng)有報(bào)道，然而粉蕉香氣和風(fēng)味較特別，其相關(guān)成熟過(guò)程香氣物質(zhì)的變化規(guī)律鮮有報(bào)道。本研究分析了粉蕉貯藏特性、粉蕉成熟過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化和香氣合成相關(guān)基因的表達(dá)特性以及它們之間的關(guān)系，以期揭示粉蕉主要揮發(fā)性物質(zhì)在成熟過(guò)程的變化規(guī)律及其與相關(guān)生理活動(dòng)的關(guān)系，為保持粉蕉采后的品質(zhì)和保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試粉蕉‘廣粉1號(hào)’（Musa ABB Pisang Awak cv.‘Guangfen No.1’），采自廣東省番禺市南沙區(qū)。

各標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、所有分離用有機(jī)溶劑（均為國(guó)產(chǎn)分析純） 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；異菌脲 江蘇快達(dá)農(nóng)化股份有限公司；輝豐百克江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；Invitrogen M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SYBR Premix ExTaq II試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5542型果蔬材料硬度測(cè)試機(jī) 美國(guó)Instron公司；香氣灰色萃取頭 美國(guó)Supelco公司；G3900型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀 日本島津有限公司；ICS3000多功能離子色譜儀 美國(guó)Dionex公司；IQ5熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國(guó)伯樂(lè)有限公司；BILON96-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海比朗公司；855-350氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；Finnigan Trace GC-質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理及取樣

蕉指落梳后，挑選果形端正、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)病蟲(chóng)斑和果實(shí)飽滿度一致的果實(shí)，采收后立刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。首先用自來(lái)水和含氯清洗劑清洗果實(shí)，然后用終質(zhì)量濃度為500 mg/L的殺菌劑異菌脲和500 mg/L的輝豐百克混合液體浸泡果實(shí)1 min，取出晾干后，裝入0.02 mm厚的聚乙烯防霧袋中，放于室溫（24±1）℃貯藏，定期監(jiān)測(cè)果實(shí)成熟進(jìn)程，取樣及測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)的組分與含量。

1.3.2 成熟相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

硬度測(cè)定：采用果蔬材料硬度測(cè)試機(jī)測(cè)定，探頭直徑為8 mm。每次重復(fù)3 個(gè)果實(shí)，將蕉橫切后均勻測(cè)定3 個(gè)部位。

可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：每個(gè)處理取3 根粉蕉，去皮后用榨汁機(jī)攪拌均勻，然后取5 g漿狀果肉于燒杯中加5 mL蒸餾水，再經(jīng)過(guò)兩層紗布過(guò)濾，使用數(shù)顯式糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，3 次重復(fù)。

成熟指數(shù)測(cè)定：香蕉的成熟分級(jí)參考Zhu Hong等[2]的方法，定期觀察，測(cè)定成熟指數(shù)。

可溶性糖含量測(cè)定：可溶性糖的提取方法與分析條件參考王海藍(lán)等[12]的方法。使用ICS3000多功能離子色譜儀對(duì)粉蕉果實(shí)糖組分和含量進(jìn)行測(cè)定。

脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氨基酸含量測(cè)定：參照Z(yǔ)hu Xiaoyang等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 果實(shí)香氣物質(zhì)的測(cè)定

參考朱虹等[4]的香氣提取方法，選用灰色萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）提取香蕉果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)。選取果實(shí)不同成熟度時(shí)期進(jìn)行香氣物質(zhì)分析：綠熟期（剛采收的生理成熟果實(shí)，采收0 d）、轉(zhuǎn)色期（果實(shí)黃綠相間、由綠轉(zhuǎn)黃時(shí)期，采收3 d）、完熟期（果實(shí)、果皮全部轉(zhuǎn)黃，采收6 d）；過(guò)熟期（果實(shí)開(kāi)始衰老，采收8 d）。取香蕉果實(shí)中段的果肉，用榨汁機(jī)壓榨成細(xì)小顆粒，取5 g果肉于20 mL采樣瓶中，密封瓶蓋，將萃取頭插入瓶中頂空部分，與樣品表面保持1.5 cm距離，萃取溫度約為常溫，萃取25 min。每個(gè)處理做3 次重復(fù)，取平均值。通過(guò)GC-MS技術(shù)，采集到的MS圖在NIST譜庫(kù)搜索，與有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行核對(duì)，同時(shí)對(duì)峰面積進(jìn)行歸一化定量，得到各組分的相對(duì)含量。再結(jié)合保留時(shí)間、MS、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)對(duì)部分組分進(jìn)一步確定，從而確定粉蕉果實(shí)中共有7 種主要揮發(fā)性物質(zhì)：乙酸異戊酯、異戊酸異戊酯、異丁酸異戊酯、乙酸己酯、己醛、反-2-己烯醛以及己醇。總揮發(fā)性物質(zhì)含量分別用不同時(shí)期揮發(fā)性物質(zhì)峰面積總和表示。同時(shí)使用GC儀對(duì)這7 種揮發(fā)性物質(zhì)在不同時(shí)期的含量進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間對(duì)GC譜圖的組分峰定性，以峰面積法定量分析各組分在貯藏過(guò)程中的含量的變化，揮發(fā)性物質(zhì)含量分別用各自物質(zhì)的出峰面積表示。

G C條件：S u p e l c o W a x 1 0極性毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）。載氣He（99.99%），流速1.0 mL/min，使用氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度220 ℃，不分流，固相微萃取進(jìn)樣，熱解吸脫附時(shí)間5 min。程序升溫：40 ℃保持1 min，以2 ℃/min升溫至60 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min。

1.3.4 RNA提取、cDNA合成和qPCR分析

RNA的提取采用熱硼酸法[13]。提取各粉蕉果肉組織樣品的總RNA，按照Invitrogen M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)，合成cDNA第1鏈，貯存于－20 ℃低溫冰箱中。

根據(jù)獲得的各個(gè)基因的序列，設(shè)計(jì)熒光引物（表1），選取MaCAC為內(nèi)參基因[14]。按SYBR Premix ExTaqII試劑盒說(shuō)明配制PCR體系，運(yùn)行程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。測(cè)定其Ct值，用2－ΔΔCt法計(jì)算樣品中各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2000軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析采用鄧肯氏新復(fù)級(jí)差檢驗(yàn)法。使用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉蕉在貯藏期間的品質(zhì)變化

表2 粉蕉采后貯藏期間的生理變化Table 2 Physiological changes during postharvest ripening of Pisang Awak bananas

由表2可以看出，粉蕉果實(shí)不耐貯藏，在采后第6天已經(jīng)完熟，在第8天就已達(dá)到過(guò)熟階段。隨著采后貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，果實(shí)硬度不斷下降，果皮顏色從深綠轉(zhuǎn)為黃綠至完熟時(shí)的金黃色。在室溫條件下，粉蕉果實(shí)在采后2 d內(nèi)硬度急劇下降，同時(shí)果實(shí)中的可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高；當(dāng)果實(shí)過(guò)熟時(shí)，硬度降到最低，可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值。

圖1 粉蕉果實(shí)成熟過(guò)程中總氨基酸、總揮發(fā)性物質(zhì)、可溶性糖含量和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig. 1 Changes in the amounts of amino acids, total volatile compounds, soluble sugar, and fatty acids during fruit ripening

由圖1可以看出，隨著果實(shí)成熟，果實(shí)中總揮發(fā)性物質(zhì)和可溶性糖的含量逐漸提高，總氨基酸含量先升高然后下降，而脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。

2.2 粉蕉采后主要揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的變化

表3 粉蕉果實(shí)采后不同成熟階段揮發(fā)性物質(zhì)成分的變化Table 3 Changes in the contents of volatiles compounds in Pisang Awak bananas at various ripening stages

從表3可以看出，不同成熟階段粉蕉果實(shí)具有的香氣物質(zhì)種類和相對(duì)含量有很大的差異，綠熟期香氣物質(zhì)種類少、含量少，隨著果實(shí)成熟，香氣物質(zhì)含量逐漸增加，在完熟期和過(guò)熟期種類和含量達(dá)到最高。果實(shí)在剛采收后的綠熟階段，其揮發(fā)性物質(zhì)主要以醛、醇、酸以及烷烴類物質(zhì)為主。其中(E,Z)-2,6-壬二烯醛以及(Z)-3-壬烯-1-醇為此階段最主要的揮發(fā)性物質(zhì)，占總揮發(fā)性物質(zhì)的26.71%。此階段的酯類物質(zhì)形成較少，只出現(xiàn)兩種含量較少的肉豆蔻酸異丙酯以及鄰苯二甲酸二異丙酯。

當(dāng)果皮處于褪綠轉(zhuǎn)黃臨界期（轉(zhuǎn)色期），揮發(fā)性物質(zhì)絕大部分是醛類，占總含量的91.11%。在這些醛類物質(zhì)中以C6醛為主，如己醛、2-己烯醛、反-2-己烯醛等，而且主要以不飽和醛為主，這些醛具有類似青草味的典型氣味，代表了轉(zhuǎn)色期粉蕉的特征揮發(fā)性物質(zhì)，而(E,Z)-2,6-壬二烯醛的含量與綠熟期相比下降。除此之外，在此階段未檢測(cè)到醇類，但存在烷烴類物質(zhì)。同時(shí)，還出現(xiàn)了一些酯類，但含量較少，說(shuō)明香氣還沒(méi)有完全形成。

在完熟階段，果實(shí)中的醛類含量急劇下降，酯類成分的比例明顯增加，這對(duì)于形成粉蕉濃郁的酯香氣作用很大。其中乙酸酯、丁酸酯和3-甲基丁酸酯類（異丁酸酯）是3 類主要成分，如乙酸異戊酯的相對(duì)含量達(dá)到18.81%，異丁酸異戊酯相對(duì)含量達(dá)到14.6%。除此之外，此階段的醇類以及烷烴類物質(zhì)都沒(méi)有檢測(cè)到，而醛類物質(zhì)含量急劇減少，部分醇類和醛類物質(zhì)可能在后期形成相應(yīng)的酯類物質(zhì)（表3）。

隨著粉蕉后熟衰老，酯類成分的種類未發(fā)生變化，但相對(duì)含量較完熟期時(shí)顯著降低；過(guò)熟期醛類物質(zhì)主要是2-己烯醛、反-2-己烯醛，這兩者的總相對(duì)含量顯著高于完熟期，5-羥甲基糠醛也在過(guò)熟期檢測(cè)到，其他醛類種類與完熟階段基本相同。酸類物質(zhì)在整個(gè)貯藏過(guò)程中都有少量出現(xiàn)。

將上述結(jié)果結(jié)合Zhu Hong[2]、朱虹[4]、Zhu Xiaoyang[6]等對(duì)香蕉和粉蕉主要揮發(fā)性物質(zhì)的分析，再結(jié)合保留時(shí)間、MS、實(shí)際成分和保留指數(shù)等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)這些峰面積較大且香氣閾值較低的異戊酸異戊酯、異丁酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯、己醛、反-2-己烯醛以及己醇對(duì)形成粉蕉不同階段的特征香氣具有關(guān)鍵性的影響。進(jìn)而利用外標(biāo)法分別對(duì)這幾種特征揮發(fā)性物質(zhì)在整個(gè)貯藏過(guò)程中的相對(duì)含量進(jìn)一步進(jìn)行定量分析。

如圖2A所示，粉蕉在完熟期的特征揮發(fā)性物質(zhì)主要是酯類物質(zhì)。在果實(shí)后熟過(guò)程中，異戊酸異戊酯、異丁酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯的含量總體上呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)，尤其是乙酸己酯和異丁酸異戊酯的含量上升較快，而異戊酸異戊酯的含量在整個(gè)貯藏期的變化不是很明顯。圖2B所示為粉蕉在未完全成熟時(shí)的特征揮發(fā)性物質(zhì)，包括乙醇、己醛和反-2-己烯醛。在果實(shí)不斷后熟過(guò)程中，己醛與反-2-己烯醛含量在貯藏后第2天達(dá)到最高值，隨后下降，而己醇的含量則在采后貯藏過(guò)程中不斷減少。直至第8天，果實(shí)達(dá)到完全成熟期時(shí)，這3 種物質(zhì)幾乎檢測(cè)不到。

圖2 粉蕉在貯藏過(guò)程中主要揮發(fā)性物質(zhì)含量的變化Fig. 2 Changes in the contents of major volatile components during fruit storage

上述這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，隨著果實(shí)不斷后熟，果實(shí)中糖不斷積累，氨基酸含量先上升后下降，揮發(fā)性物質(zhì)的組成及含量發(fā)生顯著變化。這些變化的協(xié)同作用使得粉蕉在不同后熟階段呈現(xiàn)明顯的香氣和風(fēng)味品質(zhì)的差異，形成了相應(yīng)階段的特征香氣。

2.3 香氣合成相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

圖3 香氣合成相關(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)分析Fig. 3 Expression analysis of key genes related to the synthesis of aroma compounds

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，基因LOX、AAT、ADH、PDC、BCAT和HPL在香蕉成熟過(guò)程中的表達(dá)顯著上調(diào)，與香氣物質(zhì)的合成呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，為香氣合成的關(guān)鍵基因[10-11]。LOX基因的表達(dá)量隨著果實(shí)的后熟進(jìn)程逐漸增強(qiáng)，完熟后迅速下降（圖3A）。當(dāng)果實(shí)向完熟轉(zhuǎn)化時(shí)（0～4 d），AAT基因表達(dá)急劇上升，當(dāng)果實(shí)完熟衰老時(shí)，表達(dá)量又迅速下降（圖3B）。ADH基因的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，第2天達(dá)到最大，隨后急劇下降（圖3C）。PDC基因的表達(dá)量在貯藏前期與末期較高，而在果實(shí)成熟中期表達(dá)量很低（圖3D），這可能是果實(shí)在未熟與過(guò)熟期，醛類與醇類含量比完熟時(shí)高的原因。BCAT與HPL基因在采后貯藏期間隨著果實(shí)的后熟表達(dá)不斷增強(qiáng)，在貯藏第6天（完熟時(shí)）表達(dá)量達(dá)到最大，完熟后衰老時(shí)表達(dá)量降低（圖3E、F）。

3 討 論

3.1 粉蕉采后生理生化特性的變化

已有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道，粉蕉乙烯的釋放在采后第6天達(dá)到高峰，峰值為22.3 μL/（kg·h），第10天出現(xiàn)呼吸高峰，CO2釋放量峰值為69.31 mL/（kg·h）。常溫貯藏8 d，粉蕉開(kāi)始出現(xiàn)過(guò)熟跡象[15]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。對(duì)粉蕉淀粉顆粒性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，粉蕉果肉淀粉色澤白，不易產(chǎn)生褐變[16]。果實(shí)的品質(zhì)在很大程度上取決于果實(shí)中所含糖的種類與含量[17]。有研究表明，不同果實(shí)糖積累的方式存在明顯差異。在發(fā)育過(guò)程中果實(shí)通常以淀粉、蔗糖和已糖的形式積累碳水化合物。香蕉果實(shí)發(fā)育后期可溶性糖的積累主要是蔗糖、果糖和葡萄糖的積累，其來(lái)源主要是淀粉的水解。采后蔗糖、葡萄糖、果糖含量不斷上升，且這3 種糖含量差異不顯著[18]。香蕉、粉蕉、大蕉3 個(gè)品種在剛采收與軟熟期時(shí)，粉蕉的果肉淀粉含量均最高，大蕉次之，香蕉最少；可食時(shí)，香蕉果肉蔗糖含量大于還原性糖含量，粉蕉剛達(dá)可食成熟度時(shí)，蔗糖含量較高，之后以還原糖為主[15]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，粉蕉和香蕉果實(shí)的成熟進(jìn)程有很大差異，粉蕉果實(shí)采后極易成熟劣變。粉蕉果實(shí)常溫貯藏4 d就出現(xiàn)一個(gè)明顯的呼吸躍變，在第6天時(shí)出現(xiàn)乙烯高峰，第8天又出現(xiàn)一個(gè)呼吸高峰[6]，此時(shí)由于果實(shí)已經(jīng)進(jìn)入過(guò)熟階段且開(kāi)始腐爛，病原微生物本身的呼吸作用和病原微生物侵入造成傷呼吸或傷乙烯加強(qiáng)，導(dǎo)致呼吸強(qiáng)度顯著增加。這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果[15]中呼吸躍變出現(xiàn)差異的原因可能是由于品種、采收時(shí)生理狀態(tài)以及采后貯藏條件等不同，造成了果實(shí)耐藏能力不同。粉蕉果實(shí)中主要的可溶性糖為葡萄糖、果糖與蔗糖。在剛采收時(shí)，3 種糖的含量較低，隨著果實(shí)的不斷后熟，可溶性糖含量迅速增加。當(dāng)果實(shí)完熟時(shí)主要以葡萄糖與果糖為主，蔗糖的含量有所下降[6]。

3.2 粉蕉揮發(fā)性物質(zhì)的變化

粉蕉的后熟過(guò)程伴隨著一系列生理生化反應(yīng)，從而影響了果實(shí)香氣揮發(fā)性物質(zhì)的明顯變化。粉蕉果實(shí)主要在呼吸躍變出現(xiàn)前后產(chǎn)生揮發(fā)性芳香物質(zhì)，果實(shí)在后期產(chǎn)生大量的酯類，這是果香型香氣的主要成分。有研究報(bào)道，不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的香蕉香氣的成分與含量不同[6]。全熟香蕉（6 級(jí)成熟度）中的特征香氣物質(zhì)主要有異戊醇、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、欖香脂素、異丙醇、乙酸乙酯、丁酸丁酯、異丁酸異戊酯、丁酸異戊酯、2-甲基丁酸異戊酯、戊酸異戊酯、己酸異戊酯[2]。乙酸異戊酯被認(rèn)為是最主要的特征香氣物質(zhì)[19]。香蕉在采后貯藏過(guò)程中，不同成熟階段主要香氣物質(zhì)不同，果實(shí)中的主要揮發(fā)性物質(zhì)為己醛、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、丁酸丁酯以及乙醇。己醛的含量在采后貯藏過(guò)程中先上升后下降。各酯類物質(zhì)在剛采收時(shí)含量很少或者幾乎沒(méi)有出現(xiàn)，隨著果實(shí)的不斷成熟，含量逐漸增加，后期含量達(dá)到最高[2]。沈玲[20]研究也發(fā)現(xiàn)，在綠硬香蕉果肉中主要是不飽和的烯醛和飽和的正己醛；完熟香蕉中酯類物質(zhì)所占的峰面積比例增大，對(duì)形成完熟香蕉的特征香氣起到了主要作用，因而完熟香蕉濃郁的香氣主要是酯類香氣，主要是乙酸、丁酸和戊酸等酸類和支鏈醇類脫羧形成的酯類，其中的乙酸異戊酯、丁酸異戊酯、丁酸丁酯、乙酸異丁酯4 種香氣物質(zhì)在香蕉完熟和后熟時(shí)期含量較高且閾值較低，呈現(xiàn)典型香氣，推測(cè)這幾種物質(zhì)為香蕉的特征性香氣物質(zhì)。

本課題組前期對(duì)比了香蕉和粉蕉在后熟期間香氣成分的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香蕉和粉蕉果實(shí)中都是隨著果實(shí)成熟，香氣物質(zhì)不斷增加，但粉蕉與香蕉香氣物質(zhì)的含量和種類在后熟階段有很大的差異[6]。在綠熟階段，香蕉和粉蕉果實(shí)香氣物質(zhì)都是主要以醛和醇類為主，且含量差異不顯著，而到了成熟階段，在粉蕉中，酯類物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)是先緩慢上升，然后迅速增加。與此相反，香蕉呈現(xiàn)酯類物質(zhì)含量先迅速增加、后緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但總的變化都是隨著果實(shí)的不斷完熟，酯類物質(zhì)的組分與相對(duì)含量均不斷增加。成熟粉蕉富含乙酸酯與丁酸酯類物質(zhì)，其次是一些甲基乙酸、甲基丙酸和甲基丁酸酯類，且有一些少量其他的酯類，如辛酸酯類與癸酸酯類，這與香蕉不同，從而形成粉蕉特有的香氣[6]。本研究中測(cè)定的粉蕉果實(shí)成熟過(guò)程中香氣物質(zhì)和前期結(jié)果有少許差異，主要體現(xiàn)在果實(shí)綠熟時(shí)期的醛類物質(zhì)包括己醛和2-己烯醛＋反-2-己烯醛含量、成熟期一些酯類如丁酸酯含量存在一定差異，但是總體的香氣物質(zhì)含量和特征香氣物質(zhì)含量及變化趨勢(shì)基本一致。相對(duì)于完熟期，過(guò)熟期果實(shí)中酯類物質(zhì)含量減少，而醛類物質(zhì)含量顯著增加。總體而言，粉蕉果實(shí)香氣物質(zhì)變化的基本趨勢(shì)為：粉蕉果實(shí)在未成熟階段主要以C6的醛與醇為主，并且隨著果實(shí)的不斷成熟，其含量不斷下降，且酯類物質(zhì)含量較低；到果實(shí)處于完熟期時(shí)，酯類物質(zhì)大量產(chǎn)生，其中乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、3-甲基丙酸-3-甲基丁酯（異丁酸異戊酯）含量較高，且參考相關(guān)文獻(xiàn)以及前人對(duì)香氣閾值的研究[2,4,19]，推測(cè)這幾種物質(zhì)為粉蕉的特征性香氣物質(zhì)。而綜合所有的酯類發(fā)現(xiàn)，乙酸酯、丁酸酯以及異丁酸異戊酯為主要的酯類物質(zhì)。

3.3 香氣合成相關(guān)基因與香氣的關(guān)系

果實(shí)中香氣物質(zhì)的合成主要通過(guò)脂肪酸氧化途徑與氨基酸代謝途徑[7]。在香氣合成的氨基酸代謝途徑中可能參與的酶有氨基酸轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶、乙醇脫氫酶；通過(guò)氨基酸合成途徑產(chǎn)生的香氣物質(zhì)主要是前體物質(zhì)氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶和PDC兩種關(guān)鍵酶的作用下通過(guò)轉(zhuǎn)氨基和脫羧基兩步反應(yīng)得到的[21]。在氨基酸代謝途徑中的BCAT在哈密瓜果實(shí)（Cucumis melo L.）中首次被證明可能與支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)有關(guān)[22]。在微生物中，支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用被認(rèn)為是支鏈揮發(fā)性香氣物質(zhì)合成途徑的第一步[23]。成熟香蕉釋放大量與3-甲基丁酯和3-甲基丙酯類似支鏈結(jié)構(gòu)的揮發(fā)性香氣物質(zhì)，因此BCAT可能參與了香蕉支鏈揮發(fā)性香氣物質(zhì)的合成[24]。

目前認(rèn)為，LOX參與了植物不飽和脂肪酸的代謝，為直鏈揮發(fā)性香氣物質(zhì)的生物合成提供了重要的底物。LOX途徑中包括LOX、氫過(guò)氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）和ADH等酶類。首先，LOX參與了不飽和脂肪酸的過(guò)氧化作用，在直鏈香氣物質(zhì)的生物合成途徑中起到了關(guān)鍵性的作用[25]。在HPL的作用下，果實(shí)能夠進(jìn)一步將LOX的產(chǎn)物降解為己烯醛或己醛類[26]，然而其表達(dá)模式可能存在組織特異性，這說(shuō)明LOX途徑對(duì)于香氣物質(zhì)的合成起到重要的作用。

AAT是酯類合成的關(guān)鍵酶，催化酯類合成的最后一步。在AAT的作用下，底物?；o酶A能夠通過(guò)轉(zhuǎn)酰基化與醇類底物結(jié)合，形成酯類化合物。Gonza?lez等[27]研究表明，草莓果實(shí)采后AAT活性的變化與酯類（尤其是乙酸酯與己酸酯類）的總增加量呈正相關(guān)，且與香氣相關(guān)的酯類含量變化一致，因此，AAT基因可能對(duì)于酯類的生物合成起重要作用。蘋(píng)果果實(shí)在成熟期間酯類揮發(fā)性物質(zhì)釋放量增加，但是AAT活性沒(méi)有大的變化。因此推測(cè)，酯類物質(zhì)的增加還可能與底物的供給有關(guān)[28]。

果實(shí)香氣物質(zhì)的形成與果實(shí)的成熟進(jìn)程有很大關(guān)系，乙烯作為果實(shí)成熟的主要信號(hào)因子，調(diào)控著香氣物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)。在‘Golden Delicious’蘋(píng)果果實(shí)中，乙烯參與AAT2基因調(diào)控酯類物質(zhì)的形成[10,29]。粉蕉果實(shí)中，隨著果實(shí)的不斷成熟，伴隨BCAT、AAT以及LOX基因的表達(dá)量不斷增加，酯類物質(zhì)的含量也在不斷上升，尤其是乙酸酯類。當(dāng)果實(shí)逐漸成熟到達(dá)完熟并進(jìn)入衰老時(shí)，3 個(gè)基因的表達(dá)都表現(xiàn)為不同程度的降低，此時(shí)，乙酸己酯與異丁酸異戊酯的含量達(dá)到最大，乙酸異戊酯的含量有下降的趨勢(shì)，這些結(jié)果與前人的結(jié)論[11]相同，表明BCAT、AAT以及LOX基因的表達(dá)可能受乙烯的調(diào)控，并對(duì)果實(shí)中酯類物質(zhì)的生物合成起重要作用。

在果實(shí)中，ADH與香蕉香氣中醇類和醛類的含量有著密切的聯(lián)系[5]。本研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果實(shí)中的醛類與醇類物質(zhì)含量最高時(shí)（表3），ADH基因的表達(dá)量最大（圖4C）。參與糖酵解途徑中丙酮酸的脫羧反應(yīng)，與果實(shí)在脅迫條件下的無(wú)氧呼吸密切相關(guān)，在PDC作用下，果實(shí)產(chǎn)生大量乙醇及乙酯類物質(zhì)，并且在支鏈氨基酸的合成時(shí)，可將支鏈的酮酸催化為支鏈的醛類，進(jìn)而形成支鏈的酯類；因此，其基因表達(dá)以及酶活性水平直接影響果實(shí)的香氣品質(zhì)[22]。粉蕉中，PDC基因在果實(shí)貯藏前期與后期表達(dá)量較大（圖3D），前期的大量表達(dá)可能與醇類物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，而后期可能與酯類物質(zhì)的生成有關(guān)。

4 結(jié) 論

粉蕉果實(shí)總香氣物質(zhì)含量隨著果實(shí)成熟不斷增加，而醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì)的合成主要在果實(shí)貯藏前期，酯類物質(zhì)則是在果實(shí)成熟的中后期大量合成。除基因PDC外，香氣合成關(guān)鍵基因的表達(dá)均隨著果實(shí)的成熟呈現(xiàn)出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中ADH和PDC基因在果實(shí)貯藏前期的表達(dá)量很高，對(duì)應(yīng)果實(shí)前期大量的醇類和醛類物質(zhì)的產(chǎn)生，可能主要參與了粉蕉果實(shí)醛類和醇類物質(zhì)的合成；而AAT、LOX、BACT和HPL基因表達(dá)高峰主要出現(xiàn)在果實(shí)成熟的中后期，對(duì)應(yīng)果實(shí)在中后期特征香氣物質(zhì)酯類物質(zhì)的合成，表明其可能主要參與了粉蕉果實(shí)酯類物質(zhì)的合成。

本實(shí)驗(yàn)初步揭示了特色蕉類粉蕉的貯藏特性、成熟過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化和香氣合成相關(guān)關(guān)鍵基因的表達(dá)特性以及它們之間的關(guān)系，為粉蕉采后的保鮮技術(shù)提供理論指導(dǎo)，也為后續(xù)的粉蕉果實(shí)品質(zhì)形成分子機(jī)制研究提供參考。