馬媛，陳書強(qiáng)，馬夜肥，雷暉，文亮，王曉紅

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710038)

胚胎冷凍解凍技術(shù)作為試管嬰兒的必備延伸技術(shù)，自其誕生至今發(fā)展迅速[1]。人類輔助生殖技術(shù)(ART)在控制性促排卵技術(shù)(COH)下可獲得多個(gè)卵母細(xì)胞，IVF后可獲得多枚胚胎，新鮮周期移植后剩余胚胎進(jìn)行冷凍保存以備后用。胚胎冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展進(jìn)步，減少了促排卵次數(shù)和胚胎的浪費(fèi)，從而增加了胚胎移植機(jī)會(huì)[2]。現(xiàn)有研究表明，相比于新鮮胚胎移植，胚胎玻璃化冷凍解凍移植(VET)可以改善多囊卵巢綜合征(PCOS)不孕婦女的活產(chǎn)率[3]，但在卵巢功能正常的婦女中VET并不能增加活產(chǎn)率[4]。且VET可增加多囊卵巢婦女妊娠期高血壓疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。通過VET技術(shù)出生的子代平均體重高于新鮮胚胎移植子代，巨大兒的發(fā)生率高[5]。因此該技術(shù)潛在的風(fēng)險(xiǎn)仍不明確，其安全性及對子代的影響仍然需要深入研究。

表觀遺傳修飾在生命現(xiàn)象中普遍存在，是一種特殊的基因調(diào)節(jié)方式，包括DNA甲基化、乙?；⒔M蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)節(jié)等。在原始生殖細(xì)胞中，雙親DNA甲基化模式消除并開始重新建立，在受精及后續(xù)的胚胎發(fā)育中不斷重建及維持[6]。這個(gè)敏感時(shí)期表觀遺傳學(xué)改變可能導(dǎo)致胚胎甚至成年后的多種疾病[7]。而ART中COH、胚胎體外授精、體外培養(yǎng)以及胚胎冷凍及解凍均是在胚胎表觀遺傳學(xué)修飾的關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行的，這些操作均有可能影響胚胎的表觀遺傳并對其發(fā)育及誕生的子代產(chǎn)生長遠(yuǎn)影響[8]。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道了ART技術(shù)助孕的子代出現(xiàn)了表觀遺傳紊亂及疾病[9]，因此ART技術(shù)與胚胎早期表觀遺傳改變和子代健康成為了近年研究熱點(diǎn)。

印記基因H19是目前表觀遺傳中研究比較成熟的印記基因之一，其在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控，主要參與胚胎的正常生長、胚胎發(fā)育及小兒行為發(fā)展[10]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，H19的異常甲基化狀態(tài)可導(dǎo)致Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)[11]。而銀羅素綜合征(SRS)患者中也發(fā)現(xiàn)了H19的異常低甲基化狀態(tài)[12]。因此評估胚胎玻璃化冷凍是否會(huì)導(dǎo)致H19的表達(dá)紊亂十分重要。本研究通過建立VET的小鼠模型，收集孕9.5 d胎鼠和胎盤標(biāo)本，此時(shí)期小鼠的胚胎和胎盤剛剛分化，其胎盤功能剛剛建立，相當(dāng)于人類妊娠中的早期，由于胎盤早期的功能對后期胚胎及胎盤的發(fā)育至關(guān)重要，所以我們先選擇了這個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行檢測和分析，分析該時(shí)期胎鼠和胎盤的H19表達(dá)及甲基化狀態(tài)，有助于我們探索H19對胎鼠和胎盤的不同影響及胎盤早期功能的研究分析。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小鼠品系為ICR清潔級小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雌鼠4～6周齡，雄鼠3～6月齡。

2. 主要試劑和儀器：胚胎冷凍解凍液體及栽桿購自日本Kitazato公司，胚胎培養(yǎng)采用KSOM胚胎培養(yǎng)液(Millipore，美國)，RNA提取采用TRIzol?Reagent(Invitrogen，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自日本Takara公司，DNA提取采用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德國)，亞硫酸氫鈉修飾采用EZ DNA Methylation-GoldTM KitD5005(北京天漠)，實(shí)體解剖鏡(北京Motic)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，培養(yǎng)皿(35 mm)(Nunc，丹麥)，超凈臺(tái)(Labconco，美國)，ND2000分光光度儀(Thermo，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

二、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：將雌性小鼠根據(jù)處理方式的不同分為3組，分別是：自然交配組(NC)組，體外培養(yǎng)組(IVC)組，凍胚移植組(VET)組。每組各收集7只孕鼠。NC組：分撿發(fā)情雌鼠，與雄鼠自然合籠，次日檢查陰栓，見陰栓者即為交配成功，當(dāng)日記作E0.5 d。IVC組：分撿發(fā)情雌鼠，與雄鼠自然合籠，次日檢查陰栓，見陰栓者當(dāng)日處死雌鼠，于輸卵管取受精卵，用0.3%透明質(zhì)酸酶消化，然后將消化分離的受精卵多次沖洗，轉(zhuǎn)入KSOM溶液中培養(yǎng)至囊胚后進(jìn)行胚胎移植。VET組：在IVC組基礎(chǔ)上，受精卵培養(yǎng)至8細(xì)胞時(shí)，進(jìn)行胚胎的玻璃化冷凍及復(fù)蘇，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)入KSOM溶液中培養(yǎng)至囊胚后進(jìn)行胚胎移植。

2. 胚胎玻璃化冷凍及解凍：(1)胚胎冷凍：將胚胎從培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)移至平衡液ES中，室溫下靜置5 min。隨后，轉(zhuǎn)入玻璃化冷凍液VS中，60 s以內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的載桿上，迅速投入液氮中并蓋帽保存。(2)胚胎解凍：從液氮中取出栽桿，迅速將裝有胚胎的葉片前端浸入TS液中，1 min內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至DS中，3 min后將胚胎轉(zhuǎn)移至WS1中，作用5 min，最后將胚胎移入WS2中，并將培養(yǎng)皿移至37℃熱板上加熱5 min后，轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)液中。

3. 胚胎移植及標(biāo)本收集：小鼠胚胎移植方法參照我科既往研究[13]，每只代孕鼠左右側(cè)宮腔各移植入8枚胚胎，共計(jì)16枚胚胎，移植當(dāng)日計(jì)為E3.5 d。在3組小鼠E9.5 d脫頸處死孕鼠，計(jì)算活胎率(形態(tài)正常的胎鼠即活胎)。并收集胎鼠及胎盤組織，單個(gè)存放，投入液氮備用。

4. 實(shí)時(shí)定量PCR檢測H19的表達(dá)：(1)總RNA提?。悍謩e取3只孕鼠的6個(gè)胎鼠及胎盤組織按照試劑說明進(jìn)行總RNA提取。檢測總RNA質(zhì)量，行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；(2)cDNA合成：按照試劑說明進(jìn)行cDNA合成。吸取1 μl/2 μl(1 μg/μl)總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(3)實(shí)時(shí)定量PCR：根據(jù)TaKaRa實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)總體系為20 μl：SYBR Green 10 μl，PCR特異上、下游引物按1∶1混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，滅菌蒸餾水7 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)cycle；72℃ 2 min。以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列來自Primerbank。H19引物序列：上游引物5’-CTTGTCGTAGAAGCCGTCTGTTC-3’，下游引物5’-GTAGCACCATTTCTTTCATCTTGAGG-3’；GAPDH引物序列：上游引物5’-TGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’，下游引物5’-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG-3’。每次檢測設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。在每個(gè)PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號(hào)，PCR反應(yīng)完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值)，使用 2-△△Ct法計(jì)算各組中目的基因的表達(dá)水平情況。

5. 焦磷酸測序檢測H19基因的甲基化水平：(1)引物設(shè)計(jì)：使用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共檢測2個(gè)片段，6個(gè)CpG位點(diǎn)，H19第一片段序列：上游引物5’-TGAGTTAGGGTTGGAGAGGAA-3’，下游引物5’-CCCAACAACTCCCCTTTATC-3’；H19第二個(gè)片段序列：上游引物5’-TTTGGAGTTTGGTAGGAATGTT-3’，下游引物5’-CCCAACAACTCCCCTTTATC-3’；(2)DNA提取及亞硫酸氫鈉修飾：按照試劑盒說明書提取單個(gè)胚胎及胎盤中的DNA樣品，每組取胚胎及胎盤各8個(gè)。提取后采用ND2000分光光度計(jì)測定DNA濃度以及A260/A280，比例在1.9～2.1之間說明DNA純度較好，標(biāo)本符合測定標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行后續(xù)操作。亞硫酸氫鈉修飾按照試劑盒進(jìn)行。(3)焦磷酸測序：采用測序技術(shù)對亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA樣品進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，以定量位點(diǎn)特異性甲基化水平，該實(shí)驗(yàn)部分由上海生工生物工程有限公司完成，使用PyroMarkCpG software 1.0.11進(jìn)行測序和分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、3組孕鼠妊娠結(jié)局比較

3組孕鼠各7只，IVC和VET組中每只代孕鼠移植胚胎16枚，各組共移植112枚胚胎。NC組的平均窩仔數(shù)(10.43±2.07)顯著高于IVC組的(6.43±1.51)和VET組的(6.00±1.16)(P<0.05)。比較3組孕鼠在孕9.5 d時(shí)的存活率，結(jié)果顯示，IVC組和VET組的存活率分別為40.2%和37.5%，與NC組(100.0%)比較均顯著性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IVC組與VET組兩組的存活率比較無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組孕鼠妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

注：與NC組比較，*P<0.05

二、3組孕9.5 d胚胎和胎盤組織中H19基因表達(dá)水平比較

對比3組孕9.5 d的胚胎及胎盤中H19基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示：在胚胎組織中，IVC組和VET組的H19表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05)，而IVC組和VET組間比較無顯著性差異(P>0.05)；在胎盤組織中，3組間H19表達(dá)水平比較無顯著性差異(P>0.05)(表2，圖1)。

表2 三組孕9.5 d胚胎及胎盤組織中H19基因表達(dá)水平比較(-±s)

注：與NC組比較，*P<0.05

注：與NC組比較，*P<0.05圖1 三組孕9.5 d的胚胎及胎盤組織中H19基因表達(dá)水平

三、3組H19基因甲基化水平的比較

檢測3組孕9.5 d的胚胎和胎盤組織中H19基因的甲基化水平，結(jié)果顯示：在胚胎和胎盤組織中，3組間H19基因甲基化水平比較均無顯著性差異(P>0.05)。對每一個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析結(jié)果顯示，3組H19基因甲基化水平比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3，圖2、3)。

表3 三組孕9.5 d胚胎及胎盤組織中H19基因甲基化水平比較(-±s)

A：3組胚胎組織中H19基因總體甲基化水平；B：3組胎盤組織中H19基因總體甲基化水平；C：3組胚胎組織中H19基因每個(gè)CpG位點(diǎn)分析；D：3組胎盤組織中H19基因每個(gè)CpG位點(diǎn)分析圖2 三組孕9.5 d的胚胎及胎盤中H19基因甲基化水平分析

A：3組胚胎組織中H19基因總體甲基化水平；B：3組胎盤組織中H19基因總體甲基化水平圖3 三組孕9.5 d胚胎及胎盤組織中H19基因甲基化水平檢測示例

討 論

早期胚胎所處環(huán)境對其影響巨大，并對后期甚至子代產(chǎn)生長時(shí)程影響[6]。印記基因H19是最早被發(fā)現(xiàn)的父源印記、母源表達(dá)的印記基因。在胚胎生長過程中，父源印記的基因傾向于保護(hù)母體，會(huì)適當(dāng)抑制胚胎在子宮內(nèi)的生長和發(fā)育，該印記基因的表達(dá)異常不僅可以直接對胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響，而且可以通過影響胎盤的尺寸和營養(yǎng)代謝從而對胚胎的發(fā)育造成間接影響[10，14]。在胚胎印記重新編程的過程中，玻璃化冷凍是一種醫(yī)源性應(yīng)激，可造成多種表觀遺傳紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍解凍的小鼠卵母細(xì)胞和牛卵母細(xì)胞均出現(xiàn)了印記基因紊亂，并且經(jīng)過玻璃化冷凍解凍的卵母細(xì)胞受精后，其形成的囊胚中發(fā)現(xiàn)了選擇性甲基化缺失，導(dǎo)致印記基因表達(dá)異常[15-16]。對于2-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期到囊胚期小鼠胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍解凍，均可降低胚胎整體DNA甲基化水平[17]。在通過凍融胚胎移植(FET)技術(shù)輔助受孕出生的新生兒胎盤中，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)印跡基因表達(dá)異常，而這些印記基因可能與基因表達(dá)、胚胎生長發(fā)育、細(xì)胞遷移和Ⅱ型糖尿病(T2DM)的調(diào)控有關(guān)[18]。以上證據(jù)均證明，玻璃化冷凍解凍過程可能影響胚胎的表觀基因組。所以需要更多的研究來了解該技術(shù)對表觀遺傳的影響。

本研究通過建立胚胎玻璃化冷凍解凍的小鼠模型，探索了玻璃化冷凍技術(shù)對小鼠胎盤建立早期(孕9.5 d)時(shí)胎鼠和胎盤組織中H19的表達(dá)和甲基化水平的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在孕9.5 d，IVC組及VET組的存活率顯著低于NC組小鼠；在胚胎組織中，H19基因表達(dá)水平在IVC組及VET組顯著高于NC組，但是在胎盤組織中并未發(fā)現(xiàn)H19在3組間表達(dá)的顯著差異。進(jìn)一步對胚胎和胎盤組織中H19基因的甲基化水平進(jìn)行焦磷酸測序，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)H19的甲基化水平受到影響。

既往研究中發(fā)現(xiàn)，8細(xì)胞期小鼠胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍之后培養(yǎng)至囊胚，出現(xiàn)了H19表達(dá)水平的下降，而這一調(diào)控與組蛋白修飾有關(guān)[19]。但在人類第3天卵裂期胚胎經(jīng)過玻璃化冷凍后，對發(fā)育至囊胚期的胚胎進(jìn)行檢測，其中分析了18個(gè)CpG位點(diǎn)，并未發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍對其產(chǎn)生影響[20]。2010年Wang等[21]建立小鼠模型，將玻璃化冷凍解凍后的胚胎移植入假孕受體，結(jié)果顯示，相比自然妊娠小鼠，玻璃化冷凍可導(dǎo)致E14.5的胚胎中H19基因的表達(dá)顯著增加，本研究結(jié)果與之相似，表明玻璃化冷凍組中H19基因在胎盤建立早期就已經(jīng)在胚胎中出現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象；但是在E14.5的胎盤組織中，該研究發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍組出現(xiàn)H19表達(dá)的差異性下調(diào)，而本研究3組胎盤組織中未發(fā)現(xiàn)H19基因的變化。分析原因，該研究中玻璃化冷凍的胚胎是經(jīng)過超促排卵、體外授精獲得的，而本研究中未進(jìn)行超促排卵，并且均為體內(nèi)受精，既往研究中超促排卵和體外授精均可導(dǎo)致印記基因的紊亂，故該原因可能成為潛在的影響因素。另外，我科既往研究對自然妊娠、體外培養(yǎng)和體外授精的3組小鼠孕14.5 d和孕18.5 d的胎盤H19基因表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在孕14.5 d胎盤中H19基因的表達(dá)上調(diào)，而在孕18.5 d H19基因的表達(dá)下降[22]，該研究結(jié)果也提示我們H19基因在小鼠孕期的表達(dá)呈波動(dòng)性，在孕9.5 d的胎盤組織我們雖然未發(fā)現(xiàn)H19的表達(dá)差異，但后續(xù)結(jié)果如何仍需要進(jìn)一步研究探索。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方法之一，主要修飾位點(diǎn)發(fā)生在DNA的CpG島上。本研究中對H19基因的甲基化水平進(jìn)行了分析，3組間未發(fā)現(xiàn)差異。既往研究中對H19的差異性甲基化區(qū)(DMD)的甲基化表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示胚胎中H19DMD區(qū)發(fā)生了甲基化的丟失[21，23]，故該研究認(rèn)為是H19DMD區(qū)域的甲基化丟失導(dǎo)致了H19表達(dá)水平的升高。結(jié)合既往研究，我們認(rèn)為經(jīng)過玻璃化冷凍解凍后，胚胎發(fā)育的不同階段，H19表達(dá)水平均處于變化中，這些變化均與表觀遺傳修飾直接相關(guān)。當(dāng)然，后續(xù)對H19DMD區(qū)的甲基化水平檢測以及其他修飾方式如組蛋白修飾等也是我們下一個(gè)研究的重點(diǎn)。

由以上結(jié)果看出，胚胎的玻璃化冷凍解凍及胚胎的體外培養(yǎng)均可導(dǎo)致小鼠存活率下降，胚胎組織中H19基因的水平增高。但并未發(fā)現(xiàn)胎盤組織中H19基因水平的變化，且無論是胚胎組織或胎盤組織中，H19基因甲基化水平均未發(fā)現(xiàn)變化，后期需要更多的研究加以探索。