鄒 游, 邵琳智, 吳映璇

(廣東檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 廣州 510623)

苯并咪唑類(BMZs)化合物是含有兩個氮原子的苯并雜環(huán)化合物,具有良好的生物活性[1],同時抗菌、抗病毒、抗寄生蟲等療效明顯[2],被廣泛用于農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和獸醫(yī)中。研究表明,BMZs具有致畸與致突變作用,且在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物仍具有毒理作用[3]。因此,中國、美國、歐盟等大多數(shù)國家和地區(qū)將其作為食品安全重要的監(jiān)控對象,并制定了最高殘留量(MRL)[4]。

我國最新出臺的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性食品中獸藥最大殘留限量》(征求意見稿)[5]較之前的農(nóng)業(yè)部235號公告[6]對苯并咪唑類藥物作了較大修改,不僅增加了藥物的種類,而且規(guī)范了名稱,其次對殘留標(biāo)志物也作了修改:非班太爾、芬苯達(dá)唑和奧芬達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑和奧芬達(dá)唑2-氨基砜的總和;奧苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為奧苯達(dá)唑;噻苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為噻苯達(dá)唑和5-羥基噻苯達(dá)唑;三氯苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為三氯苯達(dá)唑酮;阿苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為阿苯達(dá)唑-2-氨基砜;氟苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為氟苯達(dá)唑;甲苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物為2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑和5-羥基甲苯達(dá)唑,共涉及9種苯并咪唑類藥物,對應(yīng)殘留標(biāo)志物共11種。

苯并咪唑類藥物因其化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系,一般呈弱堿性,但其中三氯苯達(dá)唑的殘留標(biāo)志物三氯苯達(dá)唑酮為中性化合物,若要同時檢測這9種苯并咪唑類藥物的殘留標(biāo)志物,技術(shù)上存在許多困難,尤其是采用高效液相色譜法時,對于樣品的凈化具有更高的要求。然而,不管是已頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)[7,8]或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9],還是已發(fā)表的文獻(xiàn)或研究[10-18],都尚未有完全包括這11種殘留標(biāo)志物的檢測方法公開。本文采用的前處理方式具有獨創(chuàng)性,尤其是凈化技術(shù),解決了三氯苯達(dá)唑酮等幾種殘留標(biāo)志物不保留、回收率低的問題。本方法為雞組織中苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物測定標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了可靠的參考依據(jù),具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-20AD高效液相色譜儀,配自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器和二極管陣列檢測器(日本島津公司);感量0.000 01 g的分析天平和感量0.01 g的天平(德國Sartorius公司); GM 200型肉類組織搗碎機(jī)(德國Retsch公司); MS 3 basic旋渦振蕩器、減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司); SW 30H超聲波水浴(瑞士Sono Swiss公司); 3-30K離心機(jī)(德國Sigma公司)

奧芬達(dá)唑(oxfendazole, CAS號:53716-50-0)、芬苯達(dá)唑(fenbendazole, CAS號:43210-67-9)、奧芬達(dá)唑-2-氨基砜(oxfendazole sulphone, CAS號:54029-20-8)、阿苯達(dá)唑-2-氨基砜(albendazole-2-aminosulfone, CAS號:80983-34-2)、噻苯達(dá)唑(thiabendazole, CAS號:148-79-8)、5-羥基噻苯達(dá)唑(5-hydroxythiabendazole, CAS號:948-71-0)、2-氨基-5-苯甲酰基苯并咪唑(mebendazole-amine, CAS號:52329-60-9)、5-羥基甲苯達(dá)唑(5-hydroxymebendazole, CAS號:60254-95-7)、氟苯達(dá)唑(flubendazole, CAS號：31430-15-6)、奧苯達(dá)唑(oxibendazole, CAS號:20559-55-1)和三氯苯達(dá)唑酮(ketotriclabendazole, CAS號:1201920-88-8),含量均在97%以上(德國Dr. Ehrenstorfer公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Fisher公司),乙酸(色譜純,德國Merck公司);實驗室用水為超純水(符合GB/T 6682-2008一級水要求);其他未作特殊說明的試劑均為分析純;Oasis MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL,美國Waters公司)。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取

稱取5 g試樣(準(zhǔn)確至0.01 g),置于50 mL離心管中,加入15 mL乙腈溶液,超聲5 min,渦旋振蕩15 min,以4 000 r/min離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中;殘渣再加入10 mL乙腈溶液,重復(fù)上述過程,合并上清液,并用乙腈定容至刻度,搖勻,備用。

1.2.2凈化

取5 mL上述提取液,置于15 mL塑料離心管中,加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液,再加入5 mL正己烷,渦旋振蕩1 min,以10 000 r/min離心5 min,棄去上層正己烷層,下層清液加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液混勻,轉(zhuǎn)入經(jīng)過預(yù)處理的MCX固相萃取柱中,以小于1 mL/min的流速使樣品溶液全部通過小柱,棄去流出液。依次用3 mL 0.1 mol/L鹽酸-甲醇(2∶1, v/v)、4 mL 5%(v/v)氨水溶液淋洗,淋洗液全部通過小柱,棄去淋洗液。最后用4 mL 5%(v/v)氨水甲醇以0.5 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液于具刻度的濃縮瓶中。

1.2.3濃縮、定容

將收集的洗脫液于38 ℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約500 μL,加入0.1 mol/L鹽酸溶液定容至1 mL,渦旋2 min,以10 000 r/min離心5 min,待測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A為甲醇溶液,B為1%(v/v)乙酸水溶液;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:40 μL;檢測波長:292 nm。洗脫梯度見表1,梯度均為線性變化。

表 1 梯度洗脫程序

A: methyl alcohol; B: 1% (v/v) acetic acid aqueous solution.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

苯并咪唑類藥物屬于弱堿性物質(zhì),中等極性,現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)和參考文獻(xiàn)多采用C18柱進(jìn)行檢測[7-9]。針對極性較小的化合物,普通C18柱保留較弱,本方法嘗試選擇Atlantis T3色譜柱進(jìn)行分離,其鍵合和端基封尾技術(shù)的結(jié)合,不僅對極性化合物保留出色,且更加穩(wěn)定耐用,較好地改善了普通C18色譜柱堿性化合物分離不佳、柱壽命較短等狀況。

本方法在選擇流動相時,比較了有機(jī)相乙腈和甲醇溶液的分離與保留效果,發(fā)現(xiàn)并無太大差異,但使用乙腈作為有機(jī)相洗脫時會產(chǎn)生較多雜峰,使用甲醇時則雜峰較少。對于本方法中的11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物,流動相中不同酸度的水相對其分離和保留的影響較大。本方法嘗試了采用0.5%、1%和2%體積分?jǐn)?shù)的乙酸水溶液,發(fā)現(xiàn)采用1%(v/v)乙酸水溶液時，全部待測化合物的分離和保留達(dá)到最佳。因此本方法最終采用甲醇-1%(v/v)乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫。經(jīng)過色譜優(yōu)化后,得到的11種苯并咪唑類殘留標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)、空白雞肝臟樣品和加標(biāo)雞肝臟樣品(500 μg/L)的高效液相色譜圖見圖1。

圖 1 (a)11種苯并咪唑類殘留標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)溶液 (100 μg/L)、(b)空白雞肝臟樣品和(c)加標(biāo)雞肝臟樣品(500 μg/L)的色譜圖 Fig. 1 (a) Chromatograms of the 11 benzimidazoles residue marker standard solution (100 μg/L), (b) blank chicken liver sample and (c) spiked chicken liver sample (500 μg/L) 1. albendazole-2-aminosulfone; 2. 5-hydroxythiabendazole; 3. thiabendazole; 4. mebendazole-amine; 5. 5-hydroxymebendazole; 6. oxibendazole; 7. oxfendazole; 8. oxfendazole sulphone; 9. flubendazole; 10. fenbendazole; 11. ketotriclabendazole.

2.2 提取溶劑的選擇

與大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)所采用的提取溶劑不同,本文比較了乙腈、甲醇、80%(v/v)乙腈水溶液、二氯甲烷、乙酸乙酯或堿性乙酸乙酯(含0.15 mL 50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鉀水溶液,下同)[7]的提取效果。使用甲醇、80%(v/v)乙腈水溶液或二氯甲烷提取時,芬苯噠唑、奧芬噠唑等目標(biāo)物質(zhì)的回收率低于50%;使用乙腈、乙酸乙酯或堿性乙酸乙酯時,所有化合物的提取效率都超過90%。但在本方法的色譜條件下,乙腈提取時干擾峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于采用乙酸乙酯或堿性乙酸乙酯時的干擾峰。另外,乙酸乙酯或堿性乙酸乙酯提取液在后一步凈化上柱前必須進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換,常用方法為吹氮濃縮或減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,再用乙腈-0.1 mol/L鹽酸(1∶2, v/v)溶液溶解。然而濃縮過程會引起三氯苯達(dá)唑酮的降解；而采用乙腈提取則省去濃縮步驟,加入0.1 mol/L鹽酸溶液后即可上柱,且乙腈提取液對所有化合物的提取效率均可達(dá)到95%以上。因此本文選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方式的優(yōu)化

本方法比較了C18、HLB和MCX固相萃取小柱的萃取效果,使用C18和HLB小柱,且上樣溶液中乙腈的體積分?jǐn)?shù)大于10%時,奧芬達(dá)唑-2-氨基砜和5-羥基噻苯達(dá)唑會有所損失,故乙腈提取液必須先進(jìn)行濃縮,而濃縮又會導(dǎo)致待測化合物降解,且復(fù)溶解時有機(jī)溶劑含量低,溶解效果差,也會導(dǎo)致回收率降低,所以這兩種固相萃取小柱均不適用。本方法選擇采用MCX小柱,在乙腈體積與水相體積之比不超過三分之一的情況下,所有待測化合物在固相萃取柱上都能全部保留,提取液無需濃縮,可稀釋后直接上樣。

表 2 11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

采用MCX固相萃取小柱進(jìn)行凈化時,11種待測化合物存在兩種不同的保留機(jī)理,對于三氯苯達(dá)唑酮而言,填料中的N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物起反相吸附的作用;而對于其余10種化合物而言,不僅存在反相吸附作用,填料中共聚物基質(zhì)上鍵合的磺酸基還起到離子交換的作用。故對于上柱、淋洗和洗脫溶液會有更多限制條件,需要兼顧溶液的酸堿性和其中有機(jī)溶劑所占的體積分?jǐn)?shù)。按照GB/T 21324-2007《食用動物肌肉和肝臟中苯并咪唑類藥物殘留量檢測方法》中所用的過柱條件處理加標(biāo)樣品,三氯苯達(dá)唑酮會隨淋洗液流出,導(dǎo)致回收率為零。在本方法的上柱溶液中,乙腈與0.1 mol/L鹽酸溶液的體積比為1∶2,若比例為1∶1,三氯苯達(dá)唑酮幾乎不被小柱保留,損失大半,而淋洗使用的0.1 mol/L鹽酸-甲醇溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)也不宜超過30%;另一淋洗溶液5%(v/v)氨水溶液能有效去除奧芬達(dá)唑-2-氨基砜和5-羥基噻苯達(dá)唑兩個峰之間的雜質(zhì),若采用0.1 mol/L鹽酸溶液則不能去除該雜質(zhì);若用氨水乙腈洗脫,氨的體積分?jǐn)?shù)對2-氨基-5-苯甲?；讲⑦溥虻挠绊戄^大,采用5%(v/v)氨水乙腈溶液洗脫，回收率約為50%,氨的體積分?jǐn)?shù)升高,非常容易揮發(fā),導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性不好。最終,選擇了對各組分的洗脫能力比較穩(wěn)定且后續(xù)濃縮也更為容易的5%(v/v)氨水甲醇作為洗脫液。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1靈敏度

在空白雞肉、雞肝臟和雞腎臟樣品中分別添加一定濃度的苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定其S/N,以S/N≥10且回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合殘留檢測方法要求時的含量為定量限。以峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見表2)。結(jié)果表明,11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物在25～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量限能夠滿足相關(guān)監(jiān)管部門的要求。

2.4.2準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確稱取5.0 g空白試樣,置于50 mL離心管中,加入已知濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,制成低、中和高3個不同水平的雞肉、雞肝和雞腎組織樣品,每個水平做6個平行樣品,按樣品前處理過程處理后分析,計算加標(biāo)回收率(見表3)。結(jié)果表明,11種苯并咪唑類藥物的加標(biāo)回收率為70.91%～103.21%, RSD為1.48%～10.08%。

2.5 實際樣品測定

采用本方法檢測雞肉、雞肝臟及雞腎臟樣品共150份。結(jié)果顯示,1個雞肝臟樣品檢出阿苯達(dá)唑-2-氨基砜,含量為78 μg/kg,其余樣品均未檢出相關(guān)物質(zhì)。

表 3 雞肉、雞肝臟和雞腎臟樣品中11種苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜同時測定雞肉、雞肝臟和雞腎臟中苯并咪唑類藥物殘留標(biāo)志物的檢測方法。該方法定量科學(xué)準(zhǔn)確,抗干擾能力強(qiáng),基質(zhì)適應(yīng)范圍廣,可廣泛應(yīng)用于雞組織中苯并咪唑類藥物殘留的日常監(jiān)測,能夠滿足我國相關(guān)監(jiān)管部門的最新技術(shù)要求,為管理部門提供可靠有效的技術(shù)支持。