全江龍，朱雨蓓，吳正云，張文學(xué)

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065)

油橄欖是我國在20世紀(jì)60年代開始從地中海國家大批引進(jìn)的外來經(jīng)濟(jì)樹種，種植歷史達(dá)50多年，現(xiàn)已初具規(guī)模。其屬于木犀科、木樨欖屬常綠喬木，廣泛分布在我國的甘肅、四川、陜西等地[1]。據(jù)統(tǒng)計，每100 kg鮮橄欖果實榨油后就會產(chǎn)生35～40 kg果渣，往往會直接丟棄或焚燒，不僅污染環(huán)境而且浪費資源。

從文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)，油橄欖果渣中也富含動物所需的營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪、必需氨基酸、多酚類物質(zhì)等，可作為釀造食醋、醬油、功能性飲料的加工原料[2-4]。但由于其含有一些難降解成分如木質(zhì)素、單寧酸等，導(dǎo)致在食醋或醬油的釀造過程中，難以將果渣最大化利用，影響成品的風(fēng)味。所以，通過固態(tài)發(fā)酵技術(shù)不僅能提高產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量，還能降低單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，從而改善其適口性，提高油橄欖果渣的潛在利用價值[5,6]。常用于固態(tài)發(fā)酵的菌種有霉菌、酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌等[7]。

基于此，本研究采用菌種黑曲霉3.305、假絲酵母M1-1、植物乳桿菌2MM8、枯草芽孢桿菌HNDF2，通過混合雙菌對油橄欖果渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，探討不同菌種組合對發(fā)酵產(chǎn)物pH、總酚、抗氧化、單寧酸、真蛋白、粗脂肪、氨基酸的影響，對所得指標(biāo)進(jìn)一步回歸分析，并對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行成分對比進(jìn)一步優(yōu)化，旨在為油橄欖果渣的食醋、醬油釀造提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖果渣：購于四川華歐油橄欖開發(fā)有限公司；黑曲霉3.305、假絲酵母M1-1、植物乳桿菌2MM8、枯草芽孢桿菌HNDF2：購于北京市食品釀造研究所；濃硫酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀、無水乙醇、乙醚、檸檬酸鈉、濃鹽酸、沒食子酸等：均為分析純。

1.2 主要儀器

KDN-103A型定氮儀、HYP-3系列智能消化爐、SZC-101型脂肪測定儀 上海纖檢儀器儀表有限公司；S-433D型氨基酸分析儀 德國Sykam公司；UV-2450型紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

微生物發(fā)酵油橄欖果渣工藝流程見圖1。

圖1 微生物發(fā)酵油橄欖果渣工藝流程Fig.1 The technological process of microbial fermentation of olive pomace

烘干：烘箱溫度設(shè)置為80 ℃，溫度太高會使果渣焦化影響品質(zhì)。

滅菌：121 ℃濕熱高壓滅菌20 min。

營養(yǎng)鹽溶液：0.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeSO4·4H2O，0.5 g/L NaCl，0.5 g/L (NH4)2SO4，0.1 g/L葡萄糖，0.01 g/L CuCl2，調(diào)節(jié)水料比為2∶1。

活化菌種：PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)黑曲霉，YPD培養(yǎng)基用于培養(yǎng)假絲酵母，MRS培養(yǎng)基用于培養(yǎng)植物乳桿菌，LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，所有菌株均采用斜面活化。

制備種子液：將活化后的菌株傳代2次，轉(zhuǎn)移至其對應(yīng)的液體培養(yǎng)基，黑曲霉和假絲酵母在28 ℃和180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在37 ℃和200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，然后用二倍稀釋法將各菌種稀釋至約108CFU/mL。

菌落計數(shù)：用二倍稀釋法將各菌種稀釋至約108CFU/mL。

1.3.2 樣品前處理

將固態(tài)發(fā)酵后的產(chǎn)物先置于烘箱45 ℃烘24 h，至完全干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎過40目篩孔，再按照1∶20 (g/mL)加入一定量的蒸餾水，在 35 ℃下浸提3 h，趁熱抽濾獲得發(fā)酵產(chǎn)物粗提液，用于理化指標(biāo)測定。

1.3.3 指標(biāo)測定

pH的測定：采用pH計法[8]；多酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteu法，具體參考文獻(xiàn)[9]；抗氧化能力的測定：考察對DPPH的清除能力，參考文獻(xiàn)[10,11]的方法；單寧酸含量的測定：在Folin-Ciocalteu法基礎(chǔ)上做出改進(jìn)，具體參考文獻(xiàn)[12]；真蛋白的測定：采用改良后的凱氏定氮法，具體參考文獻(xiàn)[13]；粗脂肪含量的測定：采用索氏抽提法，具體參考國標(biāo)[14]；氨基酸的測定：采用氨基酸分析儀，具體參考國標(biāo)[15]。

1.3.4 感官評價

隨機(jī)選出10人組成評價小組，要求感官評定人員在評定前12 h不喝酒，不吸煙，不吃辛辣等刺激性食物，評定前后兩個樣品要以清水漱口并間隔10 min，采用目測、鼻嗅等方式逐個進(jìn)行感官評定，根據(jù)氣味、質(zhì)地、色澤3項進(jìn)行評分, 然后按得分分成優(yōu)良、良好、中等、腐敗4個等級，隨機(jī)抽取樣品的編號，按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，收集感官評定表進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 飼料的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of feed

1.3.5 指標(biāo)綜合評價

綜合評價是利用數(shù)學(xué)方法(包括數(shù)理統(tǒng)計方法)對一個復(fù)雜系統(tǒng)的多個指標(biāo)信息進(jìn)行分析處理[16]，以求得其優(yōu)劣等級的一種評價方法。在本試驗中根據(jù)各指標(biāo)對食醋、醬油品質(zhì)的影響大小，選出關(guān)鍵指標(biāo)并給予不同的權(quán)重系數(shù)，得到計算公式：

0.1Y1Y1max+0.15Y2Y2max+0.15Y3Y3max-0.2Y4Y4max+0.2Y5Y5max+0.2Y6Y6max。

其中，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6分別代表pH、總酚、抗氧化、單寧酸、真蛋白、粗脂肪。

1.3.6 均勻試驗設(shè)計混菌固態(tài)發(fā)酵試驗

由于菌種之間存在協(xié)同和拮抗作用，考慮到菌種的生長條件，本試驗將黑曲霉和假絲酵母混菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行混菌試驗。通過參考文獻(xiàn)[17,18]選取對發(fā)酵產(chǎn)物影響較大的幾個因素：混菌比例、營養(yǎng)液添加量(%)、接種量(%)、瓶裝量(g/L)進(jìn)行U7(74)均勻設(shè)計試驗，即四因素七水平優(yōu)化發(fā)酵條件，見表2。

表2 混菌發(fā)酵均勻設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and levels of uniform design for mixed fermentation

注：黑曲霉與假絲酵母混菌發(fā)酵7個試驗組分別用AC1、AC2、AC3、AC4、AC5、AC6、AC7；植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌混菌發(fā)酵7個試驗組分別用LB1、LB2、LB3、LB4、LB5、LB6、LB7，后文均以此表示。

1.3.7 驗證試驗

對所得指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到回歸方程，再通過數(shù)學(xué)模型微分求解得到最優(yōu)解，按照所得混菌固態(tài)發(fā)酵試驗的最佳優(yōu)化條件進(jìn)行驗證試驗。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SAS9.3、MatlabR2018a、SPSS20、GraphPad Prism5對試驗結(jié)果進(jìn)行作圖、回歸分析和模型預(yù)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 感官評定

根據(jù)評定結(jié)果，AC1、AC2、AC3、AC4、AC5、AC6、AC7均為二級，LB1、LB2、LB3、LB4、LB5、LB6、LB7均為一級，LB發(fā)酵果渣的氣味、質(zhì)地、色澤總分均優(yōu)于AC發(fā)酵，見圖2。

2.2 理化指標(biāo)分析

(a)

(b)

(c)

在發(fā)酵過程中，由圖3(a)可知，AC組合pH值比LB更低且pH下降速度更快。黑曲霉和假絲酵母能相互促進(jìn)生長產(chǎn)生檸檬酸等有機(jī)酸導(dǎo)致pH降低[19]。酚類化合物屬于植物次生代謝產(chǎn)物，是多羥基酚類化合物的總稱。在果渣固態(tài)發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生各種各樣的酚類物質(zhì)[20]，隨著發(fā)酵時間的延長，產(chǎn)生酚類物質(zhì)的含量越來越多，由圖3(b)可知，AC組合產(chǎn)生的酚類物質(zhì)從總體上大于LB組合，而且在后期前者還有增加的趨勢，LB組合在第7天達(dá)到發(fā)酵的最佳狀態(tài)。抗氧化性與總酚的變化趨勢大致相似，酚類物質(zhì)含量越多，其所表現(xiàn)的抗氧化性就越強(qiáng)，清除DPPH能力自然也在增加，由圖3(c)可知，在第1～5天的增長速率比較大，因為在發(fā)酵中期各菌株活性比較高，加之原料和營養(yǎng)液中可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，因此增長速率大于發(fā)酵后期，甚至有些試驗組抗氧化能力在后期還出現(xiàn)緩慢下降的趨勢。AC和LB組合都在第7天抗氧化能力達(dá)到最佳，在發(fā)酵后期，LB組合的抗氧化能力優(yōu)于AC組合，且更穩(wěn)定。

圖4 兩種混菌發(fā)酵對單寧酸、真蛋白、粗脂肪的影響Fig.4 Effect of two kinds of mixed-bacteria fermentation on tannic acid, pure protein and crude fat

由圖4可知，在發(fā)酵9 d后，LB組合對單寧酸的降解優(yōu)于AC組合，原因可能是AC混菌發(fā)酵后單寧酶酶活沒有得到促進(jìn)[21]。AC組合發(fā)酵后的真蛋白含量明顯高于LB，黑曲霉對于纖維素降解后能為假絲酵母源源不斷提供葡萄糖小分子使其產(chǎn)生菌體蛋白，所以導(dǎo)致蛋白質(zhì)增高。兩個混菌發(fā)酵組合都是2號試驗組蛋白質(zhì)略高于其他試驗組。AC和LB組合都能明顯增加粗脂肪含量，因為黑曲霉降解果渣中的纖維素為酵母菌源源不斷地提供糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，因此促進(jìn)了酵母菌的產(chǎn)脂能力[22]。

表3 發(fā)酵后果渣氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid composition and content of fermented pomace %

由表3可知，原油橄欖果渣的總氨基酸含量為1.65%，其占蛋白質(zhì)含量的83.67%，包括26種氨基酸，種類豐富。世界糧農(nóng)與衛(wèi)生組織提出最佳蛋白的氨基酸構(gòu)成模式為必需氨基酸總量(E)和非必需氨基酸總量(N)的比值應(yīng)達(dá)到0.6，必需氨基酸總量與總氨基酸含量(E+N)的比值應(yīng)達(dá)到0.4，該模式是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的方法之一[23]。經(jīng)發(fā)酵后的油橄欖果渣，結(jié)果與最佳蛋白模式的比值接近，說明其蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值較高。發(fā)酵果渣比原油橄欖果渣氨基酸總量提高了30.15%。其中，天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸含量相對于原果渣明顯上升，最高達(dá)50%。

2.3 回歸分析處理

均勻試驗見表4，再對加權(quán)后的AC組合和LB組合的總分分別進(jìn)行逐步回歸，AC組合無法輸入該模型，而對于LB組合，經(jīng)處理得到回歸方程：Y=0.26903+0.000917X2|X3+0.000127X4|X4，其中R2=0.9112，擬合程度較好。微生物發(fā)酵飼料的總分評價與營養(yǎng)液添加量和接種量的交互項成正比，與瓶裝量的二次項成正比。

表4 均勻試驗結(jié)果分析表Table 4 Analysis table of uniform experimental results

2.4 驗證試驗

結(jié)合回歸分析和Matlab軟件進(jìn)行模型預(yù)測，得到最佳工藝，即LB混菌比為1.3∶1，營養(yǎng)液添加量為13.29%，接種量為13.29%，瓶裝量為480 g/L，預(yù)測總分為0.4531。按此參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，在果渣發(fā)酵9 d后檢測各項指標(biāo)得到驗證結(jié)果：

pH為4.65，總酚為5.70%，抗氧化為92.88%，單寧酸含量為0.38%，真蛋白含量為10.06%，脂肪含量為16.25%，經(jīng)加權(quán)后得分為0.4482(參考1.3.5)，驗證效果比較好，驗證準(zhǔn)確率達(dá)98.92%。

3 結(jié)論

混菌發(fā)酵油橄欖果渣試驗中，所有試驗組在pH、總酚、抗氧化、單寧酸、真蛋白、粗脂肪、氨基酸上均明顯提高。其中，通過均勻設(shè)計試驗得到最佳工藝參數(shù)，通過比對所有試驗組的最終加權(quán)得分，且LB組合發(fā)酵在感官評定中優(yōu)于AC組合發(fā)酵，所以采用LB混菌發(fā)酵，混菌比為1.3∶1，營養(yǎng)液添加量為13.29%，接種量為13.29%，瓶裝量為480 g/L，得到最佳混菌發(fā)酵飼料，發(fā)酵9 d后，相比原油橄欖果渣，總酚提高了1.56倍，抗氧化能力最高提高了2.70倍，單寧降解率達(dá)80.90%，真蛋白最高提升了1.91倍，粗脂肪最高提高了3.04倍，經(jīng)加權(quán)后的總評分達(dá)到所有試驗組的最高值0.4482，且氨基酸種類及含量增加。整個工藝流程周期短，成本低，充分利用油橄欖果渣特性，為進(jìn)一步釀制食醋及醬油提供了參考價值。