劉 昕 孫毅海* 唐 深 陶衛(wèi)琦 李少紅 黃才勝 黃超斌 黃慧寧 謝 陽

(1 廣西南寧市第二人民醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530031；2 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530021)

隨著泌尿外科腔內(nèi)技術(shù)的發(fā)展，臨床上越來越多的患者接受腔鏡手術(shù)治療，包括輸尿管鏡、鈥激光技術(shù)。隨之而來的醫(yī)源性輸尿管損傷也逐漸增多，輸尿管損傷后出現(xiàn)的輸尿管狹窄是泌尿外科較為棘手的臨床問題之一。輸尿管狹窄的形成以及治療后狹窄復(fù)發(fā)，也成為泌尿外科醫(yī)師亟待解決的困擾[1]。本實(shí)驗(yàn)采用定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)測定正常兔輸尿管以及鈥激光損傷后兔輸尿管的瘢痕生成相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)水平，以探討鈥激光輸尿管熱損傷導(dǎo)致瘢痕狹窄的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 以10只成年新西蘭二級(jí)大白兔為實(shí)驗(yàn)對象，重量2.5～3.0 kg，年齡4～6個(gè)月。RNAlater、TRIzol等RNA保存和抽提試劑購自Life Technologies公司，引物合成、熒光定量PCR等分子生物學(xué)試劑購自Takara公司。主要儀器有島津Biospec-nano微量蛋白核酸檢測儀、羅氏480定量PCR儀、Bio-Rad水平電泳系統(tǒng)、Bio-Rad梯度PCR儀、ProteinSimple凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法 丙泊酚1.5 mg·min-1·kg-1經(jīng)兔耳緣靜脈微泵注入，持續(xù)靜脈麻醉。麻醉后取俯臥位，右側(cè)背部術(shù)野備皮，用碘伏消毒術(shù)野皮膚,鋪無菌手術(shù)巾，取右側(cè)腰部縱向切口，長約5 cm，依次切開皮膚、皮下，鈍性分離肌肉層，從腹膜后游離右腎盂及輸尿管。7號(hào)注射器針頭穿刺證實(shí)有尿液流出后，經(jīng)針頭置入200 μm鈥激光光纖，鈥激光功率設(shè)置為10 W，對輸尿管壁環(huán)形燒灼。隨后退出針頭及光纖，縫合肌層及皮膚切口。術(shù)中靜脈注射青霉素80萬單位。術(shù)后飼養(yǎng)3周，每天用碘伏清洗傷口1次，直至傷口愈合。皮膚縫線無須拆除，傷口愈合后可自行脫落，術(shù)后1只因傷口漏尿致感染死亡，1只因術(shù)中麻醉過深而死亡。

1.3 標(biāo)本采集及檢測 飼養(yǎng)3周后處死，經(jīng)腹切口取出患側(cè)(鈥激光損傷組)及健側(cè)(對照組)腎臟和輸尿管，行RT-PCR定量檢測TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3及α-SMA水平。檢測步驟：(1)合成引物；(2)利用Trizol法抽提總RNA，電泳法檢測RNA完整性，測量RNA的OD260、OD280吸光度值；(3)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；(4)熒光定量PCR引物測試；(5)SYBR Green法實(shí)時(shí)定量PCR檢測各基因表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法分析比較基因的表達(dá)差異。ΔΔCt=鈥激光損傷組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-對照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 瓊脂糖電泳 各樣本總RNA的3條電泳帶清晰，28S rRNA較18S rRNA約高出一倍，提示組織樣本未發(fā)生降解，取材良好；且各樣本紫外分光光度法測試核酸OD260/280吸光度值比值均在1.8～2.1。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各樣本抽提獲取的總RNA完整性好，符合后續(xù)的熒光定量PCR檢測各基因mRNA表達(dá)水平的要求。如圖1。

M：DNA marker(Takara DL2000)1：對照組 2：鈥激光損傷組圖1 兔輸尿管RNA瓊脂糖電泳圖

2.2 熒光定量PCR引物溶解曲線測試 各引物的溶解曲線均為單一峰，引物擴(kuò)增特異性等符合熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)要求。見圖2。

TGF-β1 TGF-β2

TGF-β3 α-SMA

2.3 定量PCR檢測結(jié)果 鈥激光損傷組TGF-β1、TGF-β2、α-SMA表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)，且α-SMA表達(dá)增幅比TGF-β1、TGF-β2更高。而兩組TGF-β3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兔輸尿管相關(guān)基因熒光定量PCR檢測結(jié)果

3 討 論

輸尿管狹窄是泌尿外科較為棘手的問題之一，嚴(yán)重的狹窄可導(dǎo)致患側(cè)上尿路梗阻，進(jìn)而使腎功能受損甚至喪失。大多數(shù)輸尿管狹窄為后天性狹窄，往往是由于輸尿管損傷所致。臨床上常見的輸尿管損傷為輸尿管結(jié)石損傷、盆腔手術(shù)損傷、輸尿管腔內(nèi)手術(shù)損傷、腫瘤放療損傷等。隨著泌尿外科腔內(nèi)技術(shù)的發(fā)展及鈥激光技術(shù)的應(yīng)用，輸尿管腔內(nèi)操作或手術(shù)導(dǎo)致的輸尿管損傷逐漸增多，因此，輸尿管腔內(nèi)損傷并狹窄形成機(jī)制的研究，以及探討干預(yù)狹窄形成的方法將對臨床工作具有重要的指導(dǎo)意義。

近年來，隨著鈥激光在泌尿外科中應(yīng)用的普及，其已經(jīng)成為泌尿外科治療的首選激光。鈥激光以其對軟組織精確的消融、氣化、切割、凝固、止血的作用，在臨床各科得到了廣泛的應(yīng)用，尤其在泌尿外科的經(jīng)腔道治療中具有不可替代的優(yōu)勢，目前多用于泌尿系統(tǒng)結(jié)石碎石、腫瘤消融、前列腺切除、輸尿管及尿道狹窄瘢痕切開等手術(shù)[2]。但是由于激光的光熱效應(yīng)，對組織可造成熱損傷，在應(yīng)用于輸尿管結(jié)石的碎石過程中，若操作不慎，可對輸尿管黏膜、肌層甚至漿膜層造成損傷。損傷后輸尿管組織在自我修復(fù)過程中形成的增生性瘢痕組織，是輸尿管損傷性狹窄的病理基礎(chǔ)。

研究表明，TGF-β在成纖維細(xì)胞中的高表達(dá)，是與瘢痕形成關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子[3]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、α-SMA與膽道損傷后瘢痕增生、狹窄形成有明確的關(guān)系[4]。TGF-β分為3個(gè)亞型，分別為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，它們在體內(nèi)具有不同的功能以維持相互之間的機(jī)體平衡，這種平衡的失調(diào)將導(dǎo)致組織器官纖維化。而α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，是瘢痕收縮的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，輸尿管鈥激光損傷后，瘢痕形成的輸尿管平滑肌中TGF-β1、TGF-β2、α-SMA表達(dá)較正常輸尿管明顯升高(P<0.05)，提示熱損傷增加了輸尿管平滑肌成纖維細(xì)胞中TGF-β1、TGF-β2、α-SMA的表達(dá)，從而導(dǎo)致平滑肌瘢痕形成及輸尿管狹窄。在體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞中，TGF-β1、TGF-β2可促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖，增強(qiáng)纖維蛋白和膠原分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，使用激光、雙氫青蒿素等物理或化學(xué)方法降低TGF-β1的分泌量可以抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的形成[5-6]。

對于輸尿管熱損傷后TGF-β3表達(dá)無明顯變化的結(jié)果，可能意味著TGF-β3不參與瘢痕形成過程。相關(guān)研究表明，TGF-β3可能有拮抗TGF-β1、TGF-β2及抑制瘢痕形成的作用[7]。輸尿管損傷后α-SMA的高表達(dá)，與TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)有關(guān)。研究表明TGF-β1、TGF-β2對α-SMA的表達(dá)有促進(jìn)作用[8]。

通過對輸尿管鈥激光損傷后相關(guān)瘢痕因子的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1、TGF-β2、α-SMA的高表達(dá)與鈥激光輸尿管損傷狹窄發(fā)生密切相關(guān)。因此，在輸尿管腔內(nèi)鈥激光操作的過程中應(yīng)避免或減少鈥激光對輸尿管的損傷，或者通過調(diào)控TGF-β亞型及α-SMA的表達(dá)減少輸尿管狹窄的發(fā)生。