楊麗娥， 葉家宏， 周楚娟， 梁芷韻， 黃月純，， 順慶生， 魏剛

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3.上海健康職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 200237；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006）

霍山石斛Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng是蘭科植物石斛屬多年生草本植物，主要分布于我國安徽省霍山縣，因其初出時(shí)“形如累米”又被稱為米斛[1]?；羯绞?，最先見載于清·趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》一書中，具有益智、益精強(qiáng)陰、輕身延年、厚腸胃、平胃氣、長肌肉等功能[1]。石斛藥用種類雖然眾多，但霍山石斛以其絕佳的內(nèi)在品質(zhì)，備受歷代醫(yī)家推崇[2]。

由于霍山石斛在自然生長環(huán)境下發(fā)芽率很低，加上長期以來無限制地采挖，霍山石斛的野生資源已難覓蹤跡[3]。目前，霍山石斛在安徽省霍山縣及鄰近地區(qū)具有小規(guī)模的栽培面積，但仍然供不應(yīng)求，價(jià)格相當(dāng)昂貴。在市場需求的驅(qū)使下，它的偽品也種類繁多[4，5]，在霍山當(dāng)?shù)爻Ｒ娨澡F皮石斛、細(xì)莖石斛冒充混淆霍山石斛，廣東地區(qū)常見美花石斛加工冒充霍山石斛。由于正品樣品來源的缺乏，目前尚未有比較可靠、完善的霍山石斛質(zhì)量控制指標(biāo)。本課題組前期進(jìn)行了霍山石斛高效液相色譜（HPLC）特征圖譜的研究，擬定了黃酮類成分指標(biāo)群[6]，后續(xù)研究中利用超高效液相色譜——電噴霧——多級(jí)質(zhì)譜（UHPLC-ESI-MSn）對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，確定了22個(gè)黃酮苷類化合物，其中包括新西蘭牡荊苷Ⅱ、新西蘭牡荊苷Ⅰ、新西蘭牡荊苷Ⅲ、夏佛塔苷、異夏佛塔苷以及金圣草素為苷元的黃酮苷類成分，對(duì)鑒別霍山石斛的真?zhèn)尉哂幸欢ㄒ饬x[7]。黃酮類化合物是霍山石斛中除多糖外的另一類主要成分，但目前仍缺乏對(duì)霍山石斛黃酮類成分含量測定方法的研究。為提供新的霍山石斛質(zhì)量控制方法，本研究通過液質(zhì)方法鑒別了霍山石斛的2個(gè)黃酮碳苷類成分，分別為夏佛塔苷和異夏佛塔苷，并建立一種同時(shí)測定霍山石斛中夏佛塔苷和異夏佛塔苷含量的方法，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器與試劑LCQ Fleet離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（四元泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器和Agilent 1200色譜工作站）（美國Agilent公司）；MS 204S（d=0.1 mg）電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；MS 105DU（d=0.01 mg）電子天平（瑞士 Mettler Toledo公司）。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

1.2試藥夏佛塔苷（純度≥92.5%，購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111912-201302）；異夏佛塔苷（含量≥99%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：121024）；1批野生霍山石斛（編號(hào)：HS-1）及10批栽培霍山石斛（編號(hào)：HS-2～HS-11）由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供，經(jīng)順慶生教授鑒定系霍山石斛Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng的莖，于60℃條件下減壓烘干，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-MS鑒別霍山石斛夏佛塔苷與異夏佛塔苷成分

2.1.1 質(zhì)譜條件 m/z掃描范圍：50～600；干燥氣溫度：300℃；Sheath Gas流速：45 L·min-1；Aux Gas流速：15 L·min-1；離子化方式：ESI（+）和ESI（-）；電噴霧電壓：3 000 V。

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Zorbax SB-Aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為340 nm，流動(dòng)相為乙腈（A）——體積分?jǐn)?shù)為0.4%的甲酸溶液（B）（V∶V=15∶85），進(jìn)樣量為5 μL。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 取夏佛塔苷和異夏佛塔苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含夏佛塔苷302 μg、異夏佛塔苷368 μg的對(duì)照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取霍山石斛粉末（過4號(hào)篩）1.0 g，精密稱定，加甲醇50 mL，回流提取4 h，取出，放冷；濾過，濾液減壓蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.5 結(jié)果與分析 化合物1與化合物2在正離子模式中分子離子峰均為m/z 565[M+H]+，負(fù)離子模式分子離子峰均為m/z 563[M-H]-，則兩者為相對(duì)分子量564的一對(duì)同分異構(gòu)體。在負(fù)離子模式二級(jí)質(zhì)譜中，出現(xiàn)m/z 503[（M-H）-60]-、m/z 473[（M-H）-90]-、m/z 443[（M-H）-120]-、m/z 383[（M-H）-90-90]-和m/z 353[（M-H）-90-120]-等碎片離子，則該化合物為芹菜素為苷元的雙糖碳苷?；衔?中相對(duì)豐度[（M-H）-60]-＜50%，化合物2中相對(duì)豐度[（M-H）-60]-＞50%，結(jié)合對(duì)照品色譜保留時(shí)間（tR）、紫外吸收光譜特征，故鑒定化合物1、2分別為夏佛塔苷、異夏佛塔苷。結(jié)果見圖1～3。

2.2霍山石斛夏佛塔苷與異夏佛塔苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax SB-Aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為340 nm，流動(dòng)相為15%體積分?jǐn)?shù)的乙腈（A）——體積分?jǐn)?shù)為0.4%的甲酸溶液（B），等度洗脫0～25 min，進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定霍山石斛粉末（過四號(hào)篩）1.0 g，精密加入甲醇50 mL，浸泡過夜，水浴加熱回流4 h，取出，放冷至室溫，濾過，用甲醇適量洗滌濾渣，合并濾液至圓底燒瓶中，減壓濃縮至約2 mL，轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定夏佛塔苷和異夏佛塔苷對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含夏佛塔苷292 μg、異夏佛塔苷482 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.4 專屬性考察 分別取夏佛塔苷、異夏佛塔苷對(duì)照品，配制成含夏佛塔苷、異夏佛塔苷的混合對(duì)照液，另準(zhǔn)備一份甲醇作為空白對(duì)照。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取夏佛塔苷和異夏佛塔苷對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 mL置5 mL容量瓶中，分別加甲醇至刻度，搖勻，即分別得夏佛塔苷和異夏佛塔苷不同梯度濃度的對(duì)照品溶液。分別依次進(jìn)樣，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。以對(duì)照品濃度[ρ/（μg·mL-1）]為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

圖1 夏佛塔苷的正/負(fù)離子二級(jí)質(zhì)譜圖（A/B）Figure 1 Secondary mass spectrogram of the positive/negative ions of schaftoside（A/B）

圖2 異夏佛塔苷的正/負(fù)離子二級(jí)質(zhì)譜圖（A/B）Figure 2 Secondary mass spectrogram of the positive/negative ions of isoschaftoside（A/B）

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，6次檢測結(jié)果夏佛塔苷平均峰面積為456.3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）為1.00%，異夏佛塔苷平均峰面積為668.0，sR為1.27%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（HS-1）5 μL，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示：夏佛塔苷平均峰面積為459.9，sR為0.94%；異夏佛塔苷平均峰面積為674.2，sR為0.95%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（HS-1）6份，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示：夏佛塔苷平均含量為0.088 0 mg/g，sR為1.80%；異夏佛塔苷平均含量為0.146 9 mg/g，sR為1.92%。表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的霍山石斛（HS-1）藥材粉末0.50 g，分別精密加入夏佛塔苷對(duì)照品溶液（84.6 μg/mL）、夏佛塔苷對(duì)照品溶液（142.8 μg/mL）各0.5 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

2.2.10 樣品的測定 取不同批次的霍山石斛樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，計(jì)算夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本研究比較了Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zorbax SB Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Zorbax SB C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）的分離效果，結(jié)果顯示以Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果較好。考察了不同柱溫（25、30、35℃）對(duì)分離效果的影響，結(jié)果顯示以30℃效果最優(yōu)，方法學(xué)符合相關(guān)要求。在供試品溶液的制備方面，比較了提取方法（超聲提取和回流提?。?、提取溶劑（80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇）及提取時(shí)間（3、4、5 h）對(duì)夏佛塔苷和異夏佛塔苷提取率的影響，結(jié)果顯示回流提取效果較好，而且濃縮處理較方便，最終確定采用甲醇回流提取4 h。

圖3 夏佛塔苷（A）、異夏佛塔苷（B）對(duì)照品和霍山石斛樣品（C）HPLC-UV圖譜（340 nm）Figure 3 HPLC-UV chromatograms of schaftoside（A），isoschaftoside（B）references and Dendrobium huoshanense sample（C）（340 nm）

圖4 霍山石斛中夏佛塔苷和異夏佛塔苷專屬性HPLC對(duì)照?qǐng)D譜Figure 4 HPLC comparison of the specificity of schaftoside and isoschaftoside in Dendrobium huoshanense

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 The results of linear relationship

本課題組前期利用UHPLC-ESI-MSn對(duì)霍山石斛[7]和紫皮石斛[8]進(jìn)行黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)解析，其中紫皮石斛確定了13個(gè)黃酮苷類化合物，包括新西蘭牡荊苷Ⅱ、新西蘭牡荊苷Ⅰ、夏佛塔苷、異夏佛塔苷等以芹菜素為苷元的黃酮碳苷，以及蘆丁、槲皮素-7-O-蕓香苷、山柰酚-3-O-蕓香苷、山柰酚-7-O-蕓香苷等以槲皮素、山柰酚為苷元的黃酮氧苷，而霍山石斛確定了包括新西蘭牡荊苷II、新西蘭牡荊苷I、新西蘭牡荊苷III、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、柚皮苷以及以金圣草素為苷元的黃酮苷類成分等22個(gè)黃酮苷類化合物，其中有11個(gè)為首次從該屬植物中分離得到。霍山石斛與紫皮石斛的黃酮苷類成分不完全相同，并且在霍山石斛黃酮類成分HPLC圖譜研究中發(fā)現(xiàn)，夏佛塔苷與異夏佛塔苷色譜峰面積在總黃酮類成分色譜峰面積中占有較大比例，說明霍山石斛中夏佛塔苷與異夏佛塔苷相對(duì)含量較高。而在紫皮石斛中夏佛塔苷、異夏佛塔苷、新西蘭牡荊苷Ⅱ與新西蘭牡荊苷Ⅰ、含量呈正相關(guān)[9]。由此可通過夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量測定為霍山石斛提供新的質(zhì)量控制方法。

表2 霍山石斛中夏佛塔苷和異夏佛塔苷加樣回收率考察結(jié)果Table 2 The results of the sample recovery test of schaftoside and isoschaftoside in Dendrobium huoshanense （n=6）

表3 11批霍山石斛中夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量測定結(jié)果Table 3 The content determination results of schaftoside and isoschaftoside in 11 batches of Dendrobium huoshanense （n=2）

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)同批次霍山石斛中，異夏佛塔苷的含量均高于夏佛塔苷，霍山石斛栽培品中不同批次兩成分含量總和差異較大，其中含量總和最高的樣品（HS-2）幾乎是含量較低的樣品（HS-9）的6倍?；羯绞脑耘嗄晗蕖⒃耘喹h(huán)境、采收時(shí)間等因素都可能會(huì)影響夏佛塔苷和異夏佛塔苷的含量。