黃永佳，楊 林，李 瑤，楊 強，楊仕鈺，張景勍

(1. 重慶醫(yī)科大學藥學院重慶高校藥物工程研究中心，重慶 400016；2. 重慶醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系，重慶 401331；3. 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心藥學部，重慶 400036)

與小分子化療藥相比，生物大分子藥物如酶、抗體等，具有特異性高和催化效力強的優(yōu)點[1]。天冬酰胺酶(asparaginase，ASNase)是一種自然界中廣泛分布的酶，其可以水解營養(yǎng)氨基酸天冬酰胺。在正常細胞中，天冬酰胺是一種非必需氨基酸，細胞可以通過自身的天冬酰胺合成酶合成天冬酰胺。然而，腫瘤細胞只能依賴于血液循環(huán)中提供的天冬酰胺，ASNase的使用會引起某些癌細胞的營養(yǎng)剝奪，從而導致腫瘤細胞死亡[2]。目前，臨床上主要將ASNase與其他小分子化療藥或放射療法聯合，用于治療急性淋巴細胞白血病。研究表明，接受ASNase治療的白血病患者其生存期明顯延長[3]。此外，ASNase在實體腫瘤，如乳腺癌[4]、卵巢癌[5]和肺癌[6]的研究中也取得了一定的效果。但是，治療過程中發(fā)生的許多嚴重不良反應，如過敏反應、凝血異常、胰腺炎等，限制了ASNase的進一步應用[7]。此外，ASNase還具有穩(wěn)定性差、生物利用度低等不足[8]。

吳茱萸堿(evodiamine，EVO)是一種天然抗腫瘤活性物質，可通過阻滯腫瘤細胞周期和誘導線粒體凋亡而抑制腫瘤細胞[9]。但EVO幾乎不溶于水，生物利用度非常低，限制了其應用[10]。前期研究發(fā)現，將EVO與環(huán)糊精制備成包合物可提高EVO的水溶性，增加其生物利用度[11]。

綜上所述，聯合ASNase的腫瘤“饑餓療法”和EVO的小分子化療機制，即一方面剝奪腫瘤細胞的營養(yǎng)供給，另一方面予以營養(yǎng)缺陷的腫瘤細胞致命打擊，理論上可以發(fā)揮良好的協同抗癌作用。為了解決兩者臨床應用上的不足，本研究首次制備了新型天冬酰胺酶-吳茱萸堿核殼型脂質納米粒(asparaginase-evodiamine core-shell lipidic nanoparticles，AELNs)。首先通過透明質酸衍生物與羥丙基-β-環(huán)糊精在緩沖液中的自組裝作用，將ASNase包封進去形成納米粒的“核”。然后與復方藥物EVO的環(huán)糊精包合物(evodiamine-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex，EH)一起包封于脂質囊殼中，從而形成具有“核-殼”型結構的納米粒。AELNs具有長循環(huán)、生物相容性好、穩(wěn)定性佳等優(yōu)勢，理論上能提高ASNase和EVO的生物利用度。

1 材料

1.1 實驗動物清潔級SD大鼠，♂，體質量(250±20)g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證編號：SCXK-(渝)2016-0001。

1.2 藥物與試劑ASNase，純度96%，來源于E.coli.，購自以色列Prospec公司；EVO，純度>99%，購自武漢遠城科技發(fā)展有限公司；天冬酰胺，純度98%，購自美國Sigma公司；Tris-HCl緩沖液(50 mmol·L-1，pH 7.3)，自配；甲醇(色譜純)，購自美國天地有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器Agilent 1100液相色譜儀(美國安捷倫公司)；UV-2600紫外分光光度計(島津儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；TGL-16B臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)。

2 方法

2.1 ASNase活性的測定

2.1.1Nessler試劑比色法 ASNase可以催化天冬酰胺分解產生游離氨，因此可以參照Nessler試劑比色法[12]，間接測定ASNase的活性。配制適當濃度的天冬酰胺溶液，加入37 ℃預熱的ASNase血漿樣品，恒溫反應10 min后，三氯乙酸終止反應。離心，取上清液，加入Nessler試劑顯色，測定紫外吸收。根據氨氮標準曲線計算反應生成的氨量。1個酶活力單位是指在實驗溫度37 ℃、pH7.3條件下，轉化1 μmol天冬酰胺所需的ASNase量。

2.1.2線性范圍 配制系列硫酸銨標準溶液，含氮濃度分別為0、40、80、200、400、480、600、800 mg·L-1，分別按“2.1.1”項處理后(ASNase血漿樣品替換為空白血漿)，最終測定的氮濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.2、1.5、2.0 mg·L-1。以不含氮組樣品為空白參比，測定其余各樣品在420 nm處的吸光度，根據氮濃度和吸光度值，繪制標準曲線。

2.1.3重復性 配制低、中、高(80、400、800 mg·L-1)濃度的硫酸銨標準溶液，每個濃度5份，分別按“2.1.1”項處理后測定吸光度值，根據氮標準曲線計算各測量值之間的RSD，考察方法的重復性。

2.1.4回收率 配制“2.1.3”項溶液，同法處理后，計算氮測得量與加入量的比值，考察方法的準確度。

2.2 EVO含量的測定

2.2.1血漿樣品的處理 吸取100 μL血漿樣品，加入10 μL內標工作液(和厚樸酚20 mg·L-1)，加入氨水(2 ∶1，V∶V)，渦旋0.5 min后，加入5倍體積的乙醚沉淀蛋白，繼續(xù)渦旋3 min。所得樣品溶液于6 000 r·min-1離心5 min，取上清液至離心管中，氮氣揮去乙醚。加入等血漿體積的甲醇復溶，渦旋，離心，取上清液40 μL進樣，檢測EVO含量。

2.2.2色譜條件 色譜柱：Lichrospher C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：225 nm；流動相：甲醇 ∶水(70 ∶30，V∶V)，柱溫：35 ℃，流速：1.0 mL·min-1。

2.2.3專屬性 取空白血漿、空白血漿+EVO+和厚樸酚、血漿樣品+和厚樸酚，分別按“2.2.1”項方法處理血漿樣品，在“2.2.2”項條件下進行分析，記錄色譜圖。

2.2.4線性范圍 配制100 mg·L-1的EVO甲醇溶液，分別用流動相稀釋至濃度為5、10、20、50、100、200、400、500、800、1 000、2 000、5 000 μg·L-1的EVO標準溶液。精密吸取SD大鼠空白血漿100 μL，分別加入上述EVO標準溶液10 μL制備模擬血漿樣品。按“2.2.1”項方法處理后，進樣檢測藥物峰和和厚樸酚峰。以EVO峰面積和和厚樸酚峰面積的比值(S∶Sr，Y)對EVO的濃度(C)做線性回歸，得標準曲線的回歸方程。

2.2.5精密度 制備低、中、高3個濃度的EVO模擬血漿樣品(EVO濃度分別為1、5、20 mg·L-1)，各濃度平行配制3份，分別按“2.2.1”項方法處理后，得到EVO濃度分別為100、500、2 000 μg·L-1的檢測樣品，在“2.2.2”項條件下進行分析，1 d內連續(xù)測定5次考察日內精密度，連續(xù)檢測5 d考察日間精密度。

2.2.6回收率 制備“2.2.5”項檢測樣品，分別測定EVO的峰面積，計算各質量濃度的平均峰面積(Ar)。配制相同質量濃度的對照品溶液直接進樣，計算平均峰面積(As)。由Ar與As的比值，分別計算低、中、高3個濃度EVO的提取回收率。

2.3 給藥方案與樣品采集

2.3.1AELNs的制備 首先稱取處方量的ASNase溶于10 g·L-1的聚乙二醇化透明質酸溶液中，將其緩慢加入60 g·L-1的羥丙基-β-環(huán)糊精溶液中，冰浴下磁力攪拌2 h即得納米制劑的“核”。接著，稱取處方量的卵磷脂和膽固醇于圓底燒瓶中，加入適量二氯甲烷溶解，減壓除去二氯甲烷至形成均勻薄膜后，加入乙醚復溶。稱取處方量的EH，連同上述“核”溶液一起加入有機相中，超聲至形成均勻帶乳光的分散體系。在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)至凝膠狀塌陷為均勻液體，即得核殼型脂質納米粒AELNs，ASNase的濃度為5×105IU·L-1。

2.3.2ASNase溶液的配制 稱取5 000 IU ASNase于10 mL容量瓶中，加入Tris-HCl緩沖液溶解并稀釋至刻度，即得5×105IU·L-1的游離ASNase溶液。

2.3.3EVO混懸液的配制 稱取5.0 mg EVO于10 mL容量瓶中，加入0.5%的羧甲基纖維鈉液助懸，稀釋至刻度即得0.5 g·L-1的EVO混懸液。

2.3.4動物實驗 將18只SD大鼠隨機分成3組，禁食不禁水12 h。分別尾靜脈注射AELNs、游離ASNase或EVO混懸液(ASNase給藥劑量為2 000 IU·kg-1，EVO給藥劑量為2 mg·kg-1)。給藥后，于不同時間點眼底靜脈采集48 h內血樣，采血體積約0.3 mL，離心，取上清液，置-20 ℃冷凍備用。

2.4 藥動學研究分別按“2.1”和“2.2”項所述方法，測定血漿樣品中ASNase和EVO的含量，繪制血藥濃度隨時間變化的曲線。根據血樣測定結果，使用DAS軟件(2.1.1版)計算藥代動力學參數，比較制劑AELNs與游離藥物ASNase或EVO的藥代動力學行為和生物利用度差異。

3 結果

3.1 ASNase測定方法學經考察，氨氮濃度在0.1～2.0 mg·L-1范圍內時，氨與Nessler試劑反應形成的絡合物，在420 nm處的吸光度與氨氮濃度呈線性相關。線性回歸方程為：Y= 0.220 5C-0.012 1(r=0.9997)。重復測定低、中、高3個濃度氨氮溶液5次結果的RSD分別為3.80%、1.08%、2.62%，平均回收率分別為112.55%、103.98%、104.27%。表明該方法重復性和準確性良好，符合測定要求。

3.2 EVO測定方法學如Fig 1所示，血漿中雜質或內源性物質對EVO的測定無干擾，表明該分析方法專屬性強。經分析，EVO濃度在5～5 000 μg·L-1時，其峰面積比(Y)與EVO的濃度(C)線性相關，標準曲線為：Y=0.001 3C+0.033 1(r=0.999 4)。低、中、高3個濃度的日內精密度分別為3.18%、1.50%、3.83%，日間精密度分別為5.00%、4.11%、3.98%，平均回收率分別為92.70%、91.19%、93.13%，均滿足方法驗證的要求。

Fig 1 Chromatograms of blank plasma(A), blankplasma+EVO+honokiol(B) and plasma sample+honokiol(C)

1:EVO;2:honokiol

3.3 AELNs中ASNase的藥動學研究以時間為橫坐標，血漿中ASNase濃度為縱坐標，繪制靜脈注射AELNs和游離ASNase后，大鼠體內ASNase的藥-時曲線。如Fig 2所示，AELNs組的AUC(0～48 h)明顯大于游離ASNase組。靜脈注射游離ASNase后，酶活性下降較AELNs快，12 h時活性消失。而AELNs組失活較慢，24 h尚有一定活性。結果表明，AELNs可延長ASNase在大鼠體內的活性保留時間。

Fig 2 Mean concentration-time curve of ASNaseafter intravenous administration in

經DAS軟件(2.1.1版)計算，得到AELNs和游離ASNase的藥代動力學參數見Tab 1(非房室模型)和Tab 2(房室模型)。從非室模型藥動學參數可知，AELNs的AUC(0～48 h)較游離ASNase增加了約39.07 U·mL-1·h-1，表明血液循環(huán)中AELNs的保留量增加；MRT(0～48h)和Cmax分別為游離ASNase的1.94倍和1.14倍，同時游離ASNase的血漿清除速率是AELNs的2.13倍，說明AELNs在血液循環(huán)中清除較慢，持續(xù)時間較長。房室模型結果與非室模型結果幾乎一致。與游離ASNase相比，AELNs的相對生物利用度約為183.15%(非房室模型)或169.11%(房室模型)。以上結果表明，AELNs延長了ASNase在大鼠體內的血液循環(huán)時間，提高了ASNase的生物利用度。

3.4 AELNs中EVO的藥動學研究繪制靜脈注射AELNs和游離EVO后大鼠體內EVO的藥-時曲線(Fig 3)。由于復方藥物EVO的靜脈給藥量(2 mg·kg-1)較低，游離EVO組血藥濃度低于檢測限而未表示出來。如Fig 3所示，靜脈注射相同劑量的AELNs(按EVO計)后，AELNs在大鼠血液循環(huán)中的保留時間長達6 h。從AELNs的非房室模型主要藥動學參數(Tab 3)可知，AELNs的Cmax可達423.37 μg·L-1，AUC(0～48 h)為527.81 μg·L-1·h-1。與張雪等[11]研究結果經劑量換算后比較，在不考慮非線性動力學的情況下，AELNs的相對生物利用度約為游離EVO的28.94倍，EH的11.64倍。以上結果說明，AELNs可延緩EVO的體內清除速率，提高EVO在大鼠體內的生物利用度。

Tab 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters ofintravenously injected AELNs and free ASNase in

Tab 2 Compartment model pharmacokinetic parameters ofintravenously injected AELNs and free ASNase in

Fig 3 Mean concentration-time curve of EVO inAELNs after intravenous administration in

ParameterNon-compartmentmodelCompartmentmodelAUC(0～48 h)/μg·L-1·h-1527.81±31.14518.48±80.66AUC(0-∞)/μg·L-1·h-1656.15±75.78664.81±100.54MRT(0～48 h)/h1.29±0.03-MRT(0-∞)/h2.36±0.39-t1/2/h-1.43±0.08CL/L·h-1·kg-10.01±0.000.01±0.00V/L·kg-10.02±0.000.02±0.00Tmax/h0.50±0.000.50±0.00Cmax/μg·L-1423.37±12.71423.37±12.71α-0.49±0.03β-0.31±0.27k10-0.42±0.04k12-0.18±0.26k21-0.34±0.23

4 討論

ASNase是一種有效的抗癌酶，其介導的是營養(yǎng)剝奪療法。該酶可以將腫瘤部位的必需氨基酸天冬酰胺水解掉，從而導致腫瘤細胞營養(yǎng)缺陷[2]，對化療藥物敏感。EVO可通過阻滯腫瘤細胞周期和誘導線粒體凋亡而抑制腫瘤細胞增殖[9]。兩種藥物的組合理論上可通過不同的作用機制增強抗癌作用。因此，本研究首次將ASNase和EVO共同包載于新型核殼型脂質納米粒AELNs中，并初步考察了AELNs在大鼠體內的藥代動力學行為。

本實驗分別采用Nessler試劑比色法和HPLC法，測定血漿樣品中ASNase和EVO的濃度，方法準確、可靠。大鼠體內藥代動力學結果顯示，AELNs的相對生物利用度約為游離ASNase的1.83倍。與張雪等[11]研究結果相比較，AELNs的相對生物利用度約為游離EVO的28.94倍。表明通過將藥物包封在核殼型脂質納米粒中，可明顯提高藥物的生物利用度。該納米粒提高ASNase生物利用度的機制可能是：① 納米粒表面的聚乙二醇可以減少載體與血液成分的相互作用，減少RES系統的攝取和腎臟的清除，從而延長納米粒在體內的半衰期[13]；② 納米粒對ASNase具有封裝保護效應，可以有效減少藥物分子與血液循環(huán)中多種代謝酶的接觸，從而減少血漿清除率；③ 納米?？梢跃S持ASNase的有效構象，提高其穩(wěn)定性和催化活性[8,12]。納米粒提高EVO生物利用度的機制除了與ASNase相同的①、②兩點外，可能還有：③ EVO屬于難溶性藥物，通過環(huán)糊精的包合技術可以增加其溶解度，改善其在體內的吸收和分布行為[11]；④ 納米粒中的脂質成分與生物細胞膜親和力強，可以增加EVO到達靶部位的量[14]。綜上所述，該新型核殼型脂質納米?？梢杂行岣逜SNase和EVO的生物利用度。

本實驗首次制備的新型自組裝核殼型脂質納米粒，不僅可以同時提高大分子藥物ASNase和小分子藥物EVO的生物利用度和延長血液循環(huán)時間，制劑結構中的透明質酸衍生物還具有腫瘤CD44受體靶向的特點[15]。因此，在本實驗基礎上，還可進一步考察AELNs的腫瘤靶向效率和協同抑癌作用，為構建生物相容性好、靶向性佳、療效可靠的蛋白多肽類藥物與小分子藥物協同遞送系統奠定良好的基礎。

(致謝: 本實驗在重慶醫(yī)科大學重慶高校藥物工程研究中心完成，在此真誠感謝實驗室的所有老師和同學。)