張蕾 郝婧瑋 宛春雷

摘要：通過正交試驗(yàn)優(yōu)化樺褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet）多糖的提取，并作用于高糖高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠，來探討樺褐孔菌多糖對小鼠高糖高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病的作用效果。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化樺褐孔菌多糖的提取，將多糖作用于高糖高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠，用ELISA方法檢測小鼠血清中的相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠肝臟明顯增大，肝指數(shù)明顯升高（P<0.01），與模型組比較，優(yōu)化提取的不同濃度樺褐孔菌多糖提取物使小鼠肝臟指數(shù)明顯下降，對肝臟有不同程度的改善，空腹血糖值下降明顯（P<0.01），高濃度給藥組（120 mg/kg）使小鼠血清中TC、LDL-C、HDL-C及ALT水平下降較明顯（P<0.01），但TG水平變化不大。病理切片結(jié)果顯示，樺褐孔菌多糖提取物給藥組小鼠肝細(xì)胞破壞程度有明顯改善，高濃度給藥組小鼠肝細(xì)胞排列更緊密，中央靜脈受累情況有明顯改善，說明樺褐孔菌多糖提取物對高糖高脂誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪肝有一定的治療效果，其機(jī)制可能是與降低血脂有關(guān)。

關(guān)鍵詞：樺褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet）;多糖;非酒精性脂肪肝;小鼠

中圖分類號(hào)：R282.71;R965? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）14-0122-04

Abstract： To study the effects of Phaeoporus obliquus polysaccharose to non-alcoholic fatty liver disease in model mice induced by high-fat-high-fructose diet. Optimizing the extraction of Phaeoporus obliquus polysaccharose by orthogonal experiments， and the polysaccharide was used in mice with high sugar and fat-induced non-alcoholic fatty liver. Results showed that compared with normal group， model group mice liver increased obviously， and liver index increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the mice liver index significantly decreased by the extraction of polysaccharides of Phaeoporus obliquus. The livers had different degrees of improvement， and the fasting blood sugar levels decreased significantly（P<0.01）. The mice serum TC， LDL-C， HDL-C and ALT levels decreased significantly the in high dosage group （120 mg/kg）（P<0.01）， except TG. Pathological results showed that mice liver cell damage have significantly improved with Phaeoporus obliquus polysaccharose. The liver cells arranged closer， central vein situation has improved significantly in high dose group. Phaeoporus obliquus polysaccharose has therapeutic effect in non-alcoholic fatty liver disease in model mice， and its mechanism may be related to lower blood lipids.

Key words： Phaeoporus obliquus; polysaccharide; NAFLD; mice

樺褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet），是一種生長在寒帶的木腐菌，主要分布于北緯45°～50°地區(qū)，包括北歐、俄羅斯、日本及中國黑龍江和吉林等地區(qū)。其化學(xué)成分包括多糖類化合物、芳香物質(zhì)、多酚類化合物、三萜類化合物等[1-4]。從16世紀(jì)以來，樺褐孔菌作為民間藥物，在預(yù)防和治療癌癥、心臟病、肝病、降血糖、胃病等疾病方面功效獨(dú)特且無明顯的毒副作用[5，6]，但尚未見樺褐孔菌皂苷對非酒精性脂肪肝病的研究報(bào)道。本研究即通過優(yōu)化提取樺褐孔菌多糖的提取物，將其作用于非酒精性脂肪肝病模型小鼠，通過檢測小鼠血清生理生化指標(biāo)及肝組織損傷程度來評(píng)價(jià)樺褐孔菌多糖提取物對非酒精性脂肪肝病的治療效果，揭示其在防治脂肪肝方面的潛在價(jià)值。

1? 材料與方法

1.1? 試劑與儀器

樺褐孔菌購于黑龍江省綏芬河市;TG、TC、LDL、HDL、ALT試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司;石蠟、乙醇購于北京化工廠;中性樹膠購自上海凱博生物有限公司;HE染色液購自Solarbio公司。

CX31型電子顯微成像系統(tǒng)（Olympus公司）;MT-360型靜音混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）;BT25S型電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)）;R20型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI Switzerland公司）。

1.2? 樺褐孔菌多糖測定

將樺褐孔菌粉末過篩，準(zhǔn)確稱取5 g粉末溶于30%的乙醇溶液中，分別改變提取條件為提取溫度、提取時(shí)間、料液比以及超聲功率，用80%的乙醇溶液沉淀多糖后，4 000 r/min離心7 min后取上清液，減壓濃縮至浸膏后水浴至干，得粗制多糖，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定含量。

1.3? 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以樺褐孔菌多糖提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，各因素與水平見表1。

1.4? 小鼠造模

將40只雄性昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物低、高劑量組，每組10只，除正常組給予普通飼料外，其余各組均給予高糖高脂飼料造模，每天定點(diǎn)對小鼠進(jìn)行灌胃，正常組和模型組小鼠灌胃等量的生理鹽水，低劑量給藥組給予60 mg/kg樺褐孔菌多糖進(jìn)行灌胃，高劑量給藥組給予120 mg/kg樺褐孔菌多糖進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃給藥處理8周。

1.5? 小鼠血糖、肝指數(shù)及生理生化指標(biāo)的測定

每周測量小鼠空腹血糖及體重;處死小鼠前稱重，處死后取下完整的肝臟用生理鹽水清洗濾紙擦干后進(jìn)行稱重，并計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）;小鼠眼眶取血后靜置10 min，3 000 r/min離心10 min取血清，然后按照試劑盒操作方法測定各組小鼠血清中ALT、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.6? 肝組織HE染色

取肝臟組織，置于10%中性甲醛溶液中進(jìn)行固定24 h，清洗后經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋后進(jìn)行常規(guī)HE染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 多糖提取優(yōu)化的結(jié)果

通過對比分析分別改變提取時(shí)間、超聲功率、提取溫度、料液比條件下樺褐孔菌多糖類物質(zhì)的提取率。結(jié)果表明，提取時(shí)間30 min、超聲功率40%，提取溫度40 ℃、料液比1∶15時(shí)樺褐孔菌中的多糖提取量最大。通過正交試驗(yàn)確定樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響樺褐孔菌多糖類物質(zhì)提取量的因素主次順序?yàn)锽>A>D>C，超聲功率和超聲時(shí)間對樺褐孔菌多糖提取效果影響相對較大，即最佳的超聲功率和超聲溫度時(shí)樺褐孔菌的多糖提取量最大，達(dá)到顯著水平（P<0.05），其次為提取溫度、料液比。綜合以上條件，樺褐孔菌多糖的最佳提取條件為A2B3C3D3，即按1∶20的料液比在溫度50 ℃下提取30 min，超聲功率為60%，乙醇濃度為30%進(jìn)行多糖含量測定（表2）。

2.2? 樺褐孔菌多糖對小鼠肝指數(shù)的影響

小鼠灌胃給藥8周后，與模型組比較，不同濃度的樺褐孔菌多糖提取物對小鼠肝臟有不同程度的改善，其中高劑量給藥組肝臟指數(shù)明顯降低，達(dá)到60.31 mg/g，低劑量給藥組的肝臟指數(shù)為69.72 mg/g（圖1）。

2.3? 樺褐孔菌多糖對小鼠血糖的影響

小鼠基礎(chǔ)水平下血糖濃度平均值為5.61 mmol/L，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始造模，然后連續(xù)灌胃給藥8周后，模型組的小鼠血糖濃度明顯升高，達(dá)到8.17 mmol/L。通過樺褐孔菌多糖灌胃給藥后小鼠血糖濃度與模型組相比較下降較明顯，其中高劑量給藥組小鼠血糖下降到6.93 mmol/L（P<0.01，N=10），低劑量給藥組小鼠血糖下降到6.51 mmol/L（P<0.01，N=9），如圖2所示。

2.4? 小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL及ALT水平檢測

灌胃給藥8周后，小鼠血清中TC、TG、LDL、HDL及ALT均有不同程度的改善。結(jié)果表明，與模型組相比，小鼠血清中的TG水平比正常組高，給藥組小鼠血清中TG含量稍有降低，但并不顯著;模型組小鼠血清中膽固醇水平為4.58 mmol/L，給藥組小鼠血清中膽固醇水平明顯下降（P<0.01），分別為2.16 mmol/L和3.32 mmol/L;與模型組相比，樺褐孔菌高濃度給藥組小鼠血清中的LDL、HDL水平顯著降低（P<0.01），分別下降到0.36 mmol/L和1.97 mmol/L，低劑量給藥組下降到0.75 mmol/L和2.52 mmol/L;與模型組相比，樺褐孔菌不同濃度給藥組小鼠血清中ALT水平下降明顯（P<0.01）（表3）。

2.5? 樺褐孔菌多糖提取物對模型小鼠形態(tài)學(xué)影響

正常組小鼠肝細(xì)胞排列緊密形狀規(guī)則，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀緊密排列;模型組小鼠肝組織出現(xiàn)了明顯的肝組織病變，肝細(xì)胞破壞嚴(yán)重，細(xì)胞腫大，排列紊亂，肝小葉中央受累更明顯;低濃度和高濃度樺褐孔菌給藥組小鼠肝細(xì)胞破壞程度有明顯改善，高濃度給藥組小鼠肝細(xì)胞排列更緊密，中央靜脈受累情況有明顯改善（圖3）。

3? 討論

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指雖無過量飲酒史但類似于酒精性脂肪肝的肝臟組織學(xué)病變的一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。目前，中國NAFLD的發(fā)病率為15%左右，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性疾病，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[7]。

本研究通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)小鼠制備NAFLD模型，該模型在發(fā)病機(jī)制上與人類的NAFLD最相似，長期的高脂飲食可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝功能損害。TG、TC、LDL-C、HDL-C是醫(yī)學(xué)上常用的血脂方面的檢測指標(biāo)，血清中TG、TC的升高可導(dǎo)致體內(nèi)血脂方面的代謝異常。LDL-C則能夠損害血管內(nèi)皮，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病甚至心肌梗死等心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因子，而 HDL-C能夠協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇、促進(jìn)其代謝為膽汁酸而表現(xiàn)出對機(jī)體的保護(hù)作用[8-11]，本研究結(jié)果顯示，給藥組小鼠血清中空腹血糖、TC、LDL-C、HDL-C水平明顯低于模型組，說明樺褐孔菌多糖提取物對NAFLD模型小鼠有一定的治療效果，但血清中TG水平變化并不明顯，說明樺褐孔菌多糖提取物可能是通過降低小鼠的膽固醇水平來發(fā)揮降脂作用，這與張麗靜[12]的芍藥苷對小鼠高脂引起的非酒精性脂肪肝研究結(jié)果相似。ALT主要分布在肝臟的肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞壞死時(shí)ALT就會(huì)升高，其升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] SHIN Y，TAMAI Y，TERAZAWA M. Chemical constituents of Inonotus boliquus，a new triterpene，21，24-cyclopentalanosta-3β，21，25-triol-8-ene from sclera-tium[J].The Japan wood research society，2001，47：313-316.

[2] CUI Y，KIM D S，PARK K C. Antioxidant effect of Inonotus obliquus[J].Journal of ethno-pharmacology，2005，96：79-85.

[3] KIM Y O，PARK H W，KIM J H，et al. Anti-cancer effect and sructural characterization of endo-polysacchride from cultivated mycelia of Inonotus obliquus[J].Life science，2006，79：72-80.

[4] SONG H S，LEE Y J，KIM S K，et al. Down regulatory effect of AGI-1120（α-glucosidase inhibitor）and Chagamushoom（Inonotus obliquus）on cellular NF-kB activation and their antioxidant activity[J].Korean Jphar-macogen，2004，35：92-97.

[5] 黃年來.俄羅斯神秘的民間藥-樺褐孔菌[J].中國食用菌，2002， 21（4）：7-8.

[6] 金? 光，楊恩月，洪淳贊.樺褐孔菌多糖抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（4）：257.

[7] 嚴(yán)煜鈞，劉仲華，林? 勇，等.茶葉中EGCG對緋鞠婧下脂肪肝大鼠的調(diào)脂保肝作用研究[J].茶葉科學(xué)，2014，34（3）：221-229.

[8] 杜秀菊，徐? 偉，穆紅梅，等.樺褐孔菌多糖的藥理活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報(bào)，2012，19（1）：100-104.

[9] 曹昌權(quán)，劉維洲.125例青年缺血性腦卒中的病因及危險(xiǎn)因素分析[J].卒中與神經(jīng)疾病，2014，21（4）：34-237.

[10] 王? 昱.油橄欖葉提取物對非酒精性脂肪肝小鼠TLR4-p38MAPK信號(hào)通路的干預(yù)作用[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)，2018， 32（3）：59-63.

[11] 周? 琴，段? 麗，吳利春，等.竹節(jié)參與丹參和山楂復(fù)方改善小鼠非酒精性脂肪肝作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（13）：1532-1535.

[12] 張麗靜.芍藥苷對小鼠高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D].武漢：武漢大學(xué)，2016.