李志滿,邵紫君,李珊珊,華 梅,孫印石

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林長春 130112)

酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)是由長期過量飲酒或酗酒所引起的肝損傷,包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化[1-2]。目前酒精性肝損傷已成為僅次于病毒性肝炎的第二大類肝病,是發(fā)展為肝硬化較為常見的原因。酒精對肝臟的損傷缺乏特異性藥物,因此,尋求有效的抗酒精性肝病的藥品和食品具有重要的意義。

人參(PanaxginsengC.A.Mey.)是五加科多年生草本植物人參的干燥根及根莖,被證實具有良好的抗癌[3-4]、保護心腦血管系統(tǒng)[5]、保護神經(jīng)系統(tǒng)[6]和抗衰老[7-8]等活性。近年來的研究表明,人參對各種實驗性肝損傷有一定的保護作用[9-10],主要是通過抗氧化、抗炎等作用保護和調(diào)節(jié)肝功能[11]。枳椇子(HoveniadulcisThunb)為鼠李科拐棗屬植物枳椇的種子,具有解酒毒,止嘔,清熱利尿等功效。有研究表明枳椇子對小鼠過量飲酒導(dǎo)致的酒精性肝損傷有預(yù)防作用[12],此外,枳椇子還能夠減輕酒精引起的大鼠肝臟脂肪變性及炎癥細胞浸潤,減少纖維增生[13]。已有研究證實人參和枳椇子合用對小鼠乙醇中毒具有保護作用[14],但兩者配伍的研究鮮有報道,并且作用機制等尚未完全明確。

本研究通過建立急性酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型,觀察使用不同配伍比例的人參枳椇子提取物對酒精性肝損傷引起的氧化應(yīng)激、肝脂質(zhì)異常沉積、炎癥因子釋放的影響,檢測了小鼠血清和肝臟相關(guān)生化指標,探討人參枳椇子對小鼠肝損傷的預(yù)防作用機理,以期為人參和枳椇子的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參 吉林省撫松豐澤農(nóng)業(yè)種植開發(fā)有限公司;枳椇子 山東濟南秦越人農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;清潔級ICR健康雄性小鼠 50只,體重為20～22 g,遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物生產(chǎn)許可證SCXK(遼)2015-0001,合格編號211002300023526;無水乙醇 北京化工廠;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferase,AST)試劑盒、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoproteins,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoproteins,LDL-C)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒和BCA法總蛋白定量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;小鼠TNF-α和IL-1βELISA試劑盒 賽默飛世爾科技有限公司;總RNA提取試劑盒 普洛麥格生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒 羅氏公司。

Epoch2型酶標儀 美國博騰儀器有限公司;NanoDrop ND-2000型超微量分光光度計 賽默飛世爾科技有限公司;C1000 Touch PCR儀 美國伯樂公司;EC3型凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司;DYY-8C型電泳儀電源 北京六一儀器廠;DKT200-4型恒溫金屬浴 杭州米歐儀器有限公司;MS204S型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司;XW-80A型微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;TP-24型快速細胞組織破碎儀 杰靈儀器制造(天津)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人參枳椇子提取物的制備 將人參和枳椇子放置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中,在60 ℃條件下干燥12 h,分別按質(zhì)量比1∶1、2∶1和1∶2混合,將干燥的混合物粉碎,過60目篩網(wǎng),向混合物中加入重量比為8倍量的蒸餾水,浸泡1 h,回流提取1 h,然后以5000 r/min,離心10 min,獲得上清液;再向殘渣中加入按重量比為5倍量的蒸餾水,回流提取0.5 h,離心,獲得上清液,合并兩次上清液,將三種水煎液放置于-80 ℃條件下冷凍4 h后,進行冷凍干燥,即為人參枳椇子提取物Ⅰ、人參枳椇子提取物Ⅱ和人參枳椇子提取物Ⅲ,產(chǎn)率分別為23.5%、33.9%和20.6%。采用香草醛-濃硫酸比色法測定提取物中的總皂苷含量分別為4.80%、5.70%和4.72%,以蘆丁為標準品采用分光光度法測評黃酮的含量為14.01、10.30和21.39 mg/g。

1.2.2 動物飼養(yǎng)管理 實驗動物在控溫(22±3) ℃并在相對濕度為55%±15%的環(huán)境中飼養(yǎng),自由進食、飲水適用一周后進行實驗。

1.2.3 急性酒精誘導(dǎo)肝損傷模型的建立 ICR小鼠適應(yīng)一周后隨機分為5組,每組10只,即為正常組、模型組、人參枳椇子提取物Ⅰ組、人參枳椇子提取物Ⅱ組和人參枳椇子提取物Ⅲ組。人參枳椇子提取物各組以100 mg/kg·bw的劑量連續(xù)灌胃小鼠,正常組及模型組按10 mL/kg·bw灌胃生理鹽水,每天灌胃1次,連續(xù)灌胃3 d。末次給藥30 min后,除正常組外,各組按6 g/kg·bw一次性灌胃50%(v/v)乙醇溶液[15],禁食不禁水,12 h后麻醉摘眼球取血,分離肝臟,肝臟保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 生化指標及炎癥因子的測定 各組小鼠取血后,室溫靜止0.5 h,在4 ℃條件下,以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min,分離得到血清,根據(jù)試劑盒說明,檢測ALT、AST活力及TG、HDL-C、LDL-C含量。采用ELISA試劑盒檢測血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.5 肝組織生化指標的測定 肝組織中SOD和GSH-Px的活力及MDA、GSH含量根據(jù)試劑盒說明書的方法進行測定。

1.2.6 肝組織中TNF-α,IL-1βmRNA表達水平 根據(jù)總RNA提取試劑盒的實驗方法提取肝組織中的總RNA,再按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將分離的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并通過使用表1中所述的基因特異性引物進行RT-PCR,GAPDH的mRNA的表達水平作為內(nèi)置參數(shù)。最后,利用含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產(chǎn)物。

表1 實時定量PCR 反應(yīng)引物序列Table 1 Sequences of primers for RT-PCR amplification

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 人參枳椇子提取物對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活力的影響

ALT和AST活力升高是反映肝細胞損傷的重要指標,因此,檢測血清中ALT和AST的活性能準確反映早期酒精性肝損傷的程度[16]。如圖1所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清中ALT和AST活力均極顯著升高(p<0.01),說明酒精引起了小鼠肝細胞受損;與模型組小鼠比較,人參枳椇子提取物Ⅰ和Ⅲ顯著降低血清中ALT的水平(p<0.05),人參枳椇子提取物Ⅱ極顯著降低ALT的水平(p<0.01),且人參枳椇子提取物Ⅰ可顯著降低AST的水平(p<0.05),人參枳椇子提取物Ⅱ和Ⅲ極顯著降低了AST的水平(p<0.01)。以上結(jié)果表明人參枳椇子提取物對酒精致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

圖1 人參枳椇子提取物對小鼠血清ALT和AST的活力的影響Fig.1 Effect of PHE on the activities of serum ALT and AST in mice注:不同小寫字母為顯著差異(p<0.05), 不同大寫字母為差異極顯著(p<0.01);相同字母為差異不顯著(p>0.05);圖2～圖4同。

2.2 人參枳椇子提取物對小鼠血清中脂質(zhì)代謝水平的影響

酒精進入體內(nèi)導(dǎo)致脂類物質(zhì)在肝臟過度沉積,促進肝內(nèi)脂類物質(zhì)TG合成增加,脂蛋白的合成及分泌受阻[17]。如圖2所示,與正常組小鼠相比,給予小鼠酒精12 h后,模型組小鼠血清中TG和LDL-C含量極顯著升高(p<0.01),HDL-C含量顯著降低(p<0.05),說明酒精誘發(fā)肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂;與模型組小鼠相比,人參枳椇子提取物Ⅰ和Ⅲ顯著降低小鼠血清中TG的含量(p<0.05),人參枳椇子提取物Ⅱ極顯著降低了小鼠血清中的TG含量(p<0.01);進一步對LDL-C和HDL-C水平檢測發(fā)現(xiàn),與模型組比較,除人參枳椇子提取物Ⅱ組外,人參枳椇子提取物Ⅰ和Ⅲ處理組中,小鼠血清中的LDL-C含量顯著降低(p<0.05),其中人參枳椇子提取物Ⅲ可顯著恢復(fù)由酒精引起的HDL-C水平降低(p<0.05)。結(jié)果表明,人參枳椇子提取物對酒精引起小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝的紊亂具有良好的緩解作用。

圖2 人參枳椇子提取物對小鼠血清TG、LDL-C和HDL-C水平的影響Fig.2 Effects of PHE on the levels of serum TG,LDL-C,and HDL-C in mice

2.3 人參枳椇子提取物對小鼠肝組織抗氧化能力的影響

酒精進入機體中可增加活性氧的水平,降低細胞抗氧化能力,減輕細胞的氧化防御作用,導(dǎo)致氧化應(yīng)激[18-19]。SOD和GSH-Px是重要的內(nèi)源性抗氧化酶,是防御氧化損傷的第一道防線[20]。GSH是一種非酶抗氧化物,具有抗氧化作用,可作為直接活性氧的清除劑[21]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,可反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度[22-23]。如圖3所示,與正常組小鼠比較,模型組小鼠肝組織中抗氧化酶和SOD活力顯著降低(p<0.05),GSH-Px的活力和GSH含量極顯著降低(p<0.01),MDA含量極顯著升高(p<0.01),說明酒精進小鼠入體內(nèi)后造成了氧化應(yīng)激;與模型組小鼠比較,人參枳椇子提取物Ⅰ處理組小鼠肝組織中GSH-Px活力顯著升高(p<0.05),SOD活力、GSH含量均極顯著升高(p<0.01),MDA水平顯著降低(p<0.05),人參枳椇子提取物Ⅱ組的小鼠肝組織中GSH-Px、SOD活力和GSH含量顯著升高,MDA水平顯著降低(p<0.05),人參枳椇子提取物Ⅲ組的小鼠肝組織中GSH-Px活力極顯著升高(p<0.01),SOD活力及中GSH的含量顯著升高(p<0.05),MDA水平極顯著降低(p<0.01)。結(jié)果說明人參枳椇子提取物可提高機體抗氧化能力,降低氧化應(yīng)激水平。

圖3 人參枳椇子提取物對小鼠肝組織中GSH-Px、SOD活性和MDA、GSH含量的影響Fig.3 Effects of PHE on GSH-Px,SOD activity and MDA,GSH content of liver tissure in mice

2.4 人參枳椇子提取物對小鼠血清中炎癥因子分泌的影響

酒精攝入導(dǎo)致的脂質(zhì)過度積累引起肝細胞直接或間接損傷,誘發(fā)炎癥的產(chǎn)生,促炎細胞因子表達增加,TNF-α和IL-1β是兩種主要促炎細胞因子[24]。如圖4所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清中TNF-α和IL-1β分泌量均顯著升高(p<0.05),說明兩種促炎因子參與了酒精引發(fā)小鼠肝損傷過程;與模型組小鼠比較,人參枳椇子提取物Ⅱ和Ⅲ能顯著降低IL-1β的含量(p<0.05),人參枳椇子提取物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)可以顯著下調(diào)血清中TNF-α的水平(p<0.05)。結(jié)果說明人參枳椇子提取物能夠有效抑制TNF-α等促炎癥因子的分泌。

圖4 人參枳椇子提取物對小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影響Fig.4 Effects of PHE on the content of TNF-α and IL-1β in the serum of mice

2.5 人參枳椇子提取物對小鼠肝臟中炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA表達的影響

通過RT-PCR檢測肝組織中炎癥因子TNF-α、IL-1βmRNA的變化情況。如圖5所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠肝組織中TNF-α和IL-1βmRNA的表達均顯著增強;人參枳椇子提取物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可抑制TNF-α和IL-1βmRNA表達水平的升高,進一步說明人參枳椇子提取物能夠抑制酒精誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子的釋放。

圖5 人參枳椇子提取物對小鼠肝組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達的影響Fig.5 Effects of PHE on the expression of TNF-α and IL-1β mRNA of liver tissure in mice

3 結(jié)論

酒精性肝病是慢性肝病的主要原因之一,已有研究報道,酒精性肝病的進展與肝內(nèi)血清轉(zhuǎn)氨酶異常、肝細胞受損造成細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和炎性浸潤等密切相關(guān)[25-30]。本實驗結(jié)果顯示人參枳椇子提取物能夠明顯降低由急性酒精攝入引起的ALT、AST活力升高,表明人參枳椇子提取物通過修復(fù)和維持肝細胞膜的完整性從而抵抗酒精所致的急性肝損傷。人參枳椇子提取物還能夠不同程度的降低TG、LDL-C的水平,升高HDL-C的含量,對酒精造成的脂質(zhì)代謝紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用。此外,人參枳椇子提取物不同程度的升高肝組織中SOD、GSH-Px活力和GSH含量,抑制了脂質(zhì)過氧化的標志物MDA的產(chǎn)生,增強了機體的抗氧化能力,改善肝組織損傷程度。并且人參枳椇子提取物能夠降低由酒精誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β水平的升高,增強機體的抗炎能力。在檢測的各指標中,人參枳椇子提取物Ⅲ處理組與模型組比較,對減輕血清中轉(zhuǎn)氨酶、肝臟中脂質(zhì)積累、抑制氧化應(yīng)激、肝臟炎癥均呈現(xiàn)出顯著性差異。由以上結(jié)果可以說明人參枳椇子提取物對酒精誘導(dǎo)的肝損傷具有一定的保護作用,為進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。